ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«Нижегородский государственный университет им. »
АДАПТАЦИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ К ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ
Учебно-методическое пособие
Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по специальности 020207 «Биофизика»
Нижний Новгород
2011
УДК 591.181 (077)
ББК Е 91/99 р
П32
П32 АДАПТАЦИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ К ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ. Авторы: , , : учебно-методическое пособие /Нижний Новгород: Издательство Нижегородского государственного университета, 2011. – 16с.
Рецензент: д. б.н. В. А. Воденеев
Учебно-методическое пособие содержит теоретические и практические основы экспериментальных исследований по регистрации биоэлектрических сигналов и длительной стимуляции нейронных сетей первичных культур гиппокампа. Описаны методы регистрации и стимуляции с обратной связью, а также программные средства, используемые в экспериментах по изучению адаптации нейронных сетей к стимуляции.
Руководство предназначено для студентов 5 курса дневного отделения, обучающихся по специальности «Биофизика», в рамках проведения одного из разделов большого практикума, а также для студентов 4-5 курсов в целях изучения курсов «Нейрональные сети мозга», «Математические модели нейродинамики».
Подготовлено при поддержке гранта РФФИ офи-м 11-04-12144 и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», контракт № 16.512.11.2136; 2.1.1/13659 по аналитической ведомственной целевой программе "Развитие научного потенциала высшей школы" (2009-2011).
Ответственный за выпуск:
председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ, д. п.н., профессор
УДК 591.181
ББК Е 91/99 р
©Нижегородский государственный
университет им. , 2011
Глава 1. Нейронные культуры на мультиэлектродных матрицах
1.1 Введение
В последнее время одним из перспективных направлений, позволяющих исследовать механизмы функционирования мозга является изучение фундаментальных принципов взаимодействия нейронов на сетевом уровне, в частности, при формировании динамических функциональных систем, лежащих в основе многих поведенческих реакций, обучения и памяти.
Клетки мозга, обладающие пластичностью, способны осуществлять очень широкий круг преобразований приложенных входных сигналов в зависимости от собственного состояния и от характеристик стимула. Преобразованные клетками сигналы в виде потенциалов действия (импульсов) распространяются по сети, вызывая поочерёдную активацию нейронов в распределенных сетевых структурах. Для исследования паттернов активности в мозге важным является возможность одновременной регистрации сигналов с различных нейронов сети.
В данной работе, для одновременной стимуляции и регистрации нейронной активности на нескольких участках сети используется мультиэлектродная матрица (МЭМ). Использование МЭМ также позволяет визуализировать пространственно-временные паттерны активности, отражающие внутреннюю динамику нейронных сетей. Электроды МЭМ регистрируют внеклеточные потенциалы на расстояниях по различным оценкам от 3 до 50 мкм. Размер электрода в используемой 64-х канальной системе MED64 (Alpha MED Sciences, Japan) варьируется от 20 до 50 мкм в различных матрицах (Рис. 1).
|
Рисунок 1. Диссоциированная культура нейронов гиппокампа на мультиэлектродной матрице системы MED64 (Alpha MED Sciences, Japan)
Параллельная регистрация сигналов в нейрональных культурах позволяет создавать модельные биологические системы для исследования такого феномена, как обучение.
С точки зрения организма, обучение выражается в относительно стойком изменении поведения, возникающим в pезультате опыта. Оно основывается на механизмах памяти - способности оpганизма к пpиобpетению и использованию опыта. Огpомное количество нейpонов в мозгу (1010) и еще большее количество синапсов затpудняют поиск доказательств тому, что способность обучаться и помнить опpеделяется стpого оpганизованными сетями синаптических взаимодействий между нейpонами головного мозга. В связи с этим чpезвычайно полезными оказались относительно пpостые модели, пpедставляющие собой нейpонную сеть из небольшого количества клеток. Например, первичные культуры эмбриональных структур мозга крыс или мышей, длительно культивируемые на матрицах, содержат от 1000 до 10000 нейронов, организующих простую нейронную сеть, доступную для изучения механизмов обучения.
Один из первых экспериментов по обучению нейрональных культур на МЕМ был реализован группой исследователей из Израильского института Технион (Marom, 2001). Нейронная сеть подвергалась серии стимуляций, каждая из которых характеризовалась такими параметрами как частота стимуляции и длительность импульса. В экспериментах по обучению частота стимуляции варьируется от 0,1 до 0,3 Гц. Использование более высокой частоты приводит к подавлению активности культуры.
Каждой сессии стимуляции предшествовала тестовая последовательность из 100 стимулов, позволяющая достоверно определить происходящие изменения в электрической активности, наблюдаемой на одном электроде. Пара стимулирующих электродов выбиралась в соответствии со способностью индуцировать распространяющуюся электрическую активность в ответ на двухфазный биполярный импульс тока (с амплитудой 50 мкА, длительностью по 250 мкс каждой фазы импульса) из расположенных рядом электродов.
Обучение сети на генерацию заданного паттерна активности происходило по следующему алгоритму. При получении в течение фиксированного временного интервала определённого ответа на входной сигнал, стимуляция приостанавливалась на 5 мин. Данная процедура повторялась до момента, когда время реакции системы на предъявленный стимул достигнет заданного значения. Было установлено, в частности, что количество стимуляций, необходимых для достижения заданного значения статистически достоверно уменьшалось при увеличении число повторов. Это факт трактовался как научение нейронной сети на генерацию требуемого ответа.
1.2. Описание системы регистрации сигналов с использованием мультиэлектродной матрицы
Регистрация внеклеточных потенциалов, характеризующая активность диссоциированной культуры гиппокампа, осуществляется параллельно по 64-м независимым каналам мультиэлектродной системы MED64 с высоким временным разрешением (20 кГц). Система MED64 (Рис. 2) состоит из следующих компонентов: усилитель, мультиэлектродная матрица (МЭМ) с 64-мя планарными электродами (Рис. 3) и коннектор для соединения матрицы с усилителем.
Рисунок 2. Система MED64 (Alpha MED Sciences, Japan)
Рисунок 3. Мультиэлектродная матрица системы MED64 с 64-мя электродами, каждый размером 50х50 мкм и расстоянием между центрами электродов 150 мкм
Мультиэлектродные матрицы или массивы микроэлектродов - устройства, которые содержат многослойные проводники, через которые передаются сигналы нейронов. На рисунке 4 приведено схематичное строение мультиэлектродной матрицы.
Рисунок 4. Схема строения электродов системы MED64
Стеклянное основание зонда (50x50x0,7 мм) содержит цилиндрическую камеру диаметром 22 мм и высотой 5 мм, в центре которой на площади 1 мм2 расположена 64-электродная матрица для регистрации спонтанной активности и электрической стимуляции нейронов. Микроэлектроды состоят из прозрачного оксида индия (In2O3), легированного оксидом олова (SnO2) (Indium tin oxide – ITO) и покрытого черной платиной. Размер электродов – 50х50 мкм, расстояние между их центрами – 150 мкм. Изолирующее покрытие – полиакриламид.
При генерации импульса возбуждения нейроны создают потоки ионов через мембраны, изменяя напряжённость электрического поля вокруг активной клетки. Это изменение регистрируется электродами МЭМ в виде импульса, типичная форма которого представлена на Рис.5.
Рисунок 5. Пример регистрации внеклеточного импульса на электроде МЭМ
Отметим, что амплитуда регистрируемого потенциала спадает с увеличением расстояния между электродом и генерирующей потенциал клеткой.
1.3 Электрическая стимуляция культуры нейронов
Электрическая стимуляция нейронной сети через пару соседних электродов последовательностью импульсов (400-800 мкс, амплитудой 400-800 мВ (Рис. 6)) с интервалом следования, соизмеримым интервалу следования спонтанных пачек (5-20 с), приводит к сетевому ответу в виде последовательности пачек. Отметим, что импульсы на стимулирующих электродах имеют противоположную полярность, что обеспечивает локализацию тока стимуляции в их окрестности и позволяет стимулировать локальные участки сети. Каждый импульс приводит к деполяризации нейронов с формированием вызванной пачечной активности. Пачка импульсов представляет собой популяционный разряд сети, регистрируемый на всех электродах матрицы в виде последовательности импульсов, следующих с высокой частотой за короткий промежуток времени (0,2-2 с).
Рисунок 6. Последовательность биполярных импульсов стимуляции с амплитудой 400 мВ и длительностью 600 мкс
На Рис. 7А приведён пример растровой диаграммы вызванной пачечной активности, где по оси абсцисс отложено время, по оси ординат - номер электрода. Точками обозначены моменты генерации импульсов на электроде.
А
Б 
Рисунок 7. А - растр вызванной пачки импульсов. Б – частотный профиль ответа на стимул в виде суммарного числа импульсов на всех электродах за каждые 50 мс после стимулов
1.4 Протокол эксперимента
Известно, что при длительной стимуляции характеристики сетевого ответа, определённые функциональными связями между нейронами, в среднем не меняются, но обладают вариабельностью.
Когда ответ на стимул удовлетворяет критерию обучения, стимуляция автоматически останавливается на 5 минут, что можно трактовать как подкрепление. Критерий обучения определяется как пороговое значение отношения суммарного количества вызванных ответов, R, удовлетворяющих критерию, к количеству стимулов, S (R/S ≥ 0,1). Временной интервал стимуляции с последующей паузой составляет период цикла. Для каждого эксперимента выбирается пара электродов, при стимуляции которых более чем 50% приложенных стимулов вызывали сетевой ответ в виде пачки. Под подкреплением понимается отключение стимуляции при получении ожидаемого ответа (достижения критерия обучения) на стимул.
В экспериментах с культурами по обучению заданной активности (возникновения потенциалов действия в заданном интервале времени после стимула) посредством длительной повторяющейся стимуляции стереотипным сигналом, система модифицирует свою структурно-функциональную организацию под влиянием внешнего воздействия. Данный эффект отражается на изменении регистрируемой активности после стимула (Рис. 8). Подобное изменение является избирательным за счёт наличия в лабораторной установке системы обратной связи. Назначение обратной связи состоит в закреплении достигнутой структурно-функциональной организации путём отключения стимуляции при достижении параметрами регистрируемой активности требуемых значений.
А
Б
Рисунок 8. А - Гистограмма ответов после стимулов на одном электроде до обучения. Б - Гистограмма ответов после стимулов после обучения содержит больше импульсов, чем до обучения
Контрольные вопросы
1. Что регистрируют электроды мультиэлектродной матрицы?
2. Какого типа сигнал подаётся на электроды при стимуляции?
3. Чему равна оптимальная частота следования стимулов, вызывающая сетевой отклик в культуре клеток?
Глава 2. Практическая часть
2.1. Компоненты экспериментальной установки
Для проведения эксперимента по обучению используются следующие оборудование и программное обеспечение:
1) Культура нейронов гиппокампа, выращенная на мультиэлектродной матрице системы MED64. Используется культура на 20-й или более поздний день развития и должна обладать спонтанной регулярной пачечной активностью.
2) Система MED64.
3) Стимулятор MultiChannel Systems STG 4004 и прилагаемое программное обеспечение.
4) Компьютер для управления регистрацией и стимуляцией культуры.
5) Плата АЦП/ЦАП National Instruments PCI-6221.
6) Программа NLearn.
2.2. Подготовка экспериментальной установки
1) Установить МЭМ зонд с культурой клеток в соединяющее устройство (коннектор), подключенному к усилителю системы MED64 (MED64 Amplifier).
2) Проверить подключение всех кабельных соединений: соединения выхода стимулятора STG 4004 с входом "EXT STIM 1" на усилителе MED64, выбор стимулируемого электрода на передней панели усилителя MED64, соединения выхода с используемого электрода на усилителе MED64 с аналоговым входом "AI1" АЦП, подключенного к компьютеру регистрации-стимуляции.
3) В соответствующие гнезда на передней панели усилителя MED64 вставить штекер от внешнего стимулятора STG 4004 для подачи сигнала.
4) Включить усилитель MED64, компьютер MED64, компьютер, управляющий регистрацией/стимуляцией и внешний стимулятор STG 4004.
5) Произвести калибровку усилителя MED64 с помощью программы MED Conductor.
6) Запустить на компьютере управления стимуляцией-регистрацией программу NLearn.
2.3. Методика регистрации сигналов с использованием мультиэлектродной матрицы
После подготовки установки управление экспериментом осуществляется с помощью программы NLearn. Данная программа осуществляет регистрацию сигналов с одного электрода мультиэлектродной матрицы, детектирование импульсов, автоматическое управление стимуляцией и анализ вызванных ответов на стимул.
Сигнал, полученный с электрода, программно пропускается через низкочастотный фильтр. Частота, выше которой сигнал поступает на дальнейший анализ, устанавливается в поле "Filter frequency". Затем устанавливается коэффициент чувствительности порога детектирования импульсов "Sigma threshold" в диапазоне от 4 до 8 так, чтобы на графике детектированных импульсов не отображались фоновые межпачечные импульсы. Порог детектирования в милливольтах отображается в поле "Threshold Value" (Рис. 9).
Рисунок 9. Окно программы Nlearn с основными элементами управления параметрами регистрации импульсов
2.4. Стимуляция культуры нейронов
Для проведения эксперимента по обучению нейронов на мультиэлектродной матрице необходимо убедиться, что стимуляция выбранной пары электродов вызывает пачку активности в сети клеток. Кнопка включения/выключения стимуляции "Stimulation ON/OFF" запускает генерацию последовательности импульсов напряжения на аналоговом выходе ЦАП с частотой, заданной в поле "Stimulation frequency (Hz)" на вкладке "Stimulation". Каждый импульс длительностью 400 мс и напряжением 5 В на выходе ЦАП запускает генерацию импульса напряжения на стимуляторе STG 4004. Импульс далее проходит через выбранную пару электродов, деполяризуя клетки, находящиеся вблизи.
Стимуляция продолжается в течение двух минут. Для эксперимента выбираются только электроды, стимуляция которых способна вызывать пачки импульсов на более чем 50% стимулов. Далее выбирается интервал времени после стимула, в котором регистрируется количество вызванных импульсов (динамическая характеристика ответа). Данный интервал выбирается таким, чтобы отношение суммарного количества ответов на количество стимулов (R/S) при стимуляции была равна <= 0,1. Чаще всего интервал равен 40-80 мс.
На вкладке "Stimulation" кнопка "Trail stimulation ON/OFF" включает циклы стимуляции с заданными параметрами: длительность стимуляции указывается в поле "Seconds to stim", длительность перерывов – в поле "seconds to rest". По умолчанию период непрерывной стимуляции установлен длительностью 600 секунд и перерыв между стимуляцией - 300 секунд (Рис. 10).
Рисунок 10. Окно модуля управления параметрами стимуляции
2.5. Обучение культуры нейронов
Перед экспериментом по обучению с обратной связью необходимо произвести контрольную запись стимуляции без обратной связи. Для этого, проделав действия, описанные в пунктах (2.1-2.3), включается режим «Trail stimulation» на протяжении двух-трёх часов. В поле "R/S" на вкладке «Post stim characteristics» в реальном времени отображается значения R/S после каждого стимула. Цель контрольного эксперимента – подтверждение отсутствия эффекта адаптации без подкрепления.
Далее следует эксперимент с обратной связью в автоматическом режиме. Стимуляция по установленному протоколу (10 мин стимуляция, 5 мин перерыв) вызывает различные значения динамической характеристики ответа (R/S) на регистрируемом электроде. Если в течение стимуляции параметр R/S достигает порогового значения > 0,1, стимуляция автоматически отключается на заданный период времени (5 мин). Время от начала периода стимуляции до достижения порога определяется как время адаптации.
Режим обратной связи активируется с помощью кнопки "Closed loop" на вкладке "Stimulation". Критерий обучения в виде порогового значения R/S устанавливается в поле "Learn Threshold (Spikes or R/S)" (Рис. 11).
Рисунок 11. Окно модуля управления критерием обучения и гистограммой отклика импульсов после стимула
На вкладке "Learning curves" во время эксперимента в таблице добавляются времена адаптации после каждого цикла стимуляции. Также во время эксперимента строится кривая обучения - зависимость времени адаптации от номера цикла стимуляции. Для достоверной оценки появления эффекта обучения эксперимент должен длиться не менее 3 часов.
Полученные кривые обучения анализируются на наличие эффекта обучения - уменьшения времени адаптации (Рис. 12). Если эффект присутствует, то считается, что функциональная связь между нейронами на стимулирующем и регистрирующем электродах изменилась с формированием новых или модификацией старых путей распространения сигнала возбуждения.
Рисунок 12. Кривая обучения
Контрольные вопросы
1. Каким требованиям должна удовлетворять вызванная активность на электроде для стимуляции?
2. Как определяются динамические характеристики ответа на стимул?
3. Как определяется время адаптации культуры нейронов гиппокампа в эксперименте по обучению с обратной связью?
4. Для чего проводится контрольный эксперимент по стимуляции без обратной связи?
5. Как строится кривая обучения?
Список литературы:
1. , , Корягина матрицы – новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. Современные технологии в медицине, №1, 2009, С. 8-15.
2. , , Казанцев и вариабильность паттернов сетевой активности развивающихся нейрональных сетей мозга: биологические и математические модели // Труды научной сессии НИЯУ МИФИ-2010, т. 3, сс. 184-192, 2010.
3. Shahaf G. and Marom S. Learning in networks of cortical neurons // J. Neurosci. 2001. V. 21. P. 8782–8788.
4. Marom S., Shahaf G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy // Q. Rev. Biophys. 2002. V. 35. P. 63-87.
5. le Feber J, Stegenga J, Rutten WLC. The Effect of Slow Electrical Stimuli to Achieve Learning in Cultured Networks of Rat Cortical Neurons // PLoS ONE. 2010. 5(1): e8871. doi:10.1371/journal. pone.0008871.
6. Shahaf G., Eytan D., Gal A., Kermany E., Lyakhov V., et al. Order-Based Representation in Random Networks of Cortical Neurons // PLoS Comput Biol. 2008. 4(11): e1000228. doi:10.1371/journal. pcbi.1000228.
7. Wagenaar D. A., Madhavan R., Pine J., Potter S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 2005; 25: 680-688.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1. Нейрональные культуры на мультиэлектродных матрицах. 3
1.1 Введение. 3
1.2. Описание системы регистрации сигналов с использованием мультиэлектродной матрицы.. 5
1.3 Электрическая стимуляция культуры нейронов. 6
1.4 Протокол эксперимента. 7
Контрольные вопросы.. 8
Глава 2. Практическая часть. 9
2.1 Компоненты экспериментальной установки. 9
2.2 Подготовка экспериментальной установки. 9
2.3 Методика регистрации сигналов с использованием мультиэлектродной матрицы 9
2.4 Стимуляция культуры нейронов. 10
2.5 Обучение культуры нейронов. 11
Контрольные вопросы.. 13
Литература. 14
АДАПТАЦИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ К ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ
Авторы:
Алексей Сергеевич Пимашкин
Екатерина Александровна Корягина
Арсений Андреевич Гладков и др.
Учебно-методическое пособие
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«Нижегородский государственный университет им. ».
603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.
Усл. печ. л. . Уч.-изд. л. .
Заказ № . Тираж 70 экз.
Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета
им.
603600, 7
Лицензия ПД от 14.05.01
