ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ ОРХИДНЫХ, ЗАНЕСЁННЫХ В КРАСНУЮ КНИГУ
Брянский государственный университет им. Акад. , 241036, 4. E-mail: *****@***ru
Широкий спектр применения орхидных человеком (выставки, коммерческие цели, медецина, пищевая промышленность, парфюмерия и др.), возрастающая антропогенная нагрузка на природу и процессы естественных смен одних сообществ на другие приводят к стремительному сокращению численности природных популяций данного семейства в Европейской флоре [1].
С целью сохранения генетического разнообразия возникает необходимость сведений о генетической структуре семейства, создания молекулярной систематики семейства. Этой цели можно добиться исследуя межвидовой, внутри - , и межпопуляционный полиморфизм редких и исчезающих видов орхидных. Наиболее современным и информативным подходом является полимеразная цепная реакция с использованием ISSR - и RAPD - праймеров. Эти методы отличаются относительной простотой реализации и достаточной воспроизводимостью. Результатом амплификации является набор фрагментов, который может быть использован в качестве молекулярного маркера вида[2].
Целью данного исследования является изучение межвидового полиморфизма растений, занесённых в красную книгу России, семейства Орхидные.
Методы
Объектом исследования служили 19 видов Орхидных, занесённых в красную книгу Брянской области.
Выделение ДНК проводили из навески сухой растительной ткани методом, приведенным в [3], модифицированным для для данного вида.
Определение концентрации полученного раствора ДНК проводили методом спектрофотометрии на приборе T70 UV/VIS Spectrometer (PG Instruments Ltd.), пользуясь для пересчета соотношением: 1 о. е. соответствует 50 мкг/мл ДНК.
PCR проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). В работе использовали ISSR - и RAPD-праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва), и ферменты и реактивы, поставляемые фирмой «СибЭнзим» (Москва).
Реакционная смесь для ISSR - и RAPD PCR объемом 20 мкл содержала следующие компоненты: 1 ед. Taq-полимеразы, 2 мкл буфера, 5 мМ MgCl2, 0,25 мМ каждого dNTP, 90 пМ каждого из праймеров, 0,2 - 2 мкг тотальной геномной ДНК. Смесь покрывали 20 мкл вазелинового масла.
При амплификации ISSR праймеров начальная денатурация проводилась в течение 5 (1 для RAPD-праймера) мин при 94°С. Далее для 35 циклов условия были следующие: денатурация при 94°С – 45 с (1 мин для RAPD праймера), температура отжига 52°С для ISSR-праймеров (26°С для RAPD-праймера) – 45 с (2 мин для RAPD-праймера) и элогация при 72°С 1,30 мин; заключительная элонгация 7 мин при 72°С. Температуру отжига праймеров определяли с помощью программы Vector NTI (Invitrogen).
Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с буфером TBE в присутствии бромистого этидия и визуализировали на UV-трансиллюминаторе. В качестве маркера молекулярной массы использовали M27. При ISSR-анализе учитывали как мажорные так и минорные фрагменты ДНК, при RAPD-анализе - только мажорные полосы. Полиморфными считались фрагменты ДНК, присутствующие на электрофореграммах не всех сортов.
Результаты
Данную работу провели на 19 видах Орхидных, занесённых в красную книгу Брянской области. Материалы для исследования были получены из коллекции гербария Брянского государственного университета им. акад. . Для выявления генетического межвидового полиморфизма были использованы 14 RAPD-праймеров и 16 ISSR-праймеров. Характеристика праймеров приведена в таблице 1.
Таблица 1. Характеристика праймеров, использованных в работе
№ | Название праймера | Состав праймера | № | Название праймера | Состав праймера |
RAPD-праймеры | |||||
1 | OPA03 | agt-cag-cca-c | 8 | OPM20 | agg-tct-tgg-g |
2 | OPA11 | caa-tcg-ccg-t | 9 | OPN03 | ggt-act-ccc-c |
3 | OPC07 | gtc-ccg-acg-a | 10 | OPN04 | gac-cga-ccc-a |
4 | OPD11 | agc-gcc-att-g | 11 | OPN06 | gag-acg-cac-a |
5 | OPJ07 | cct-ctc-gac-a | 12 | OPN09 | tgc-cgg-ctt-g |
6 | OPJ10 | aag-ccc-gag-g | 13 | OPN10 | aca-act-ggg-g |
7 | OPM16 | gta-acc-agc-c | 14 | OPN14 | tcg-tgc-ggg-t |
ISSR-праймеры | |||||
15 | UBC809 | (ag)8-g | 23 | IS3 | (gа)8-c |
16 | UBC810 | (ga)8-g | 24 | IS4 | (ca)8-a |
17 | UBC823 | (tс)8-c | 25 | IS5 | (ca)8-rc |
18 | UBC824 | (tc)8-g | 26 | IS6 | (ag)8-yt |
19 | UBC826 | (ac)8-c | 27 | RN1 | acg-gtg-cgt-g |
20 | UBC840 | (ga)8-yt | 28 | RN2 | cgg-gga-gga-a |
21 | IS1 | (ag)8-yg | 29 | RN3 | gct-gca-ggc-c |
22 | IS2 | (ac)8-g | 30 | RN4 | ggt-cgc-agc-t |
С помощью использованных ISSR - и RAPD-праймеров удалось получить полиморфные полосы характерные для видов. Разные виды Орхидных дают сильно различающиеся профили, что проиллюстрировано на рис. 1 на примере праймера IS 1, IS 3.
А 
Б
Рис. 1. ISSR - профили нескольких видов семейства Орхидные: А - использован праймер IS 1, Б - использован праймер IS 3.
Разные виды семейства Орхидные дают абсолютно различный набор полос, что отражает межвидовой полиморфизм. Однако, можно наблюдать и полосы, которые являются сходными между видами. Из представленных на рисунках результатов видно, что в подобранных условиях на электрофореграммах наблюдаются четкие полосы ПЦР-фрагментов в диапазоне молекулярных весов от 200 до 3000 п. н.
Налюдаемый уровень полиморфизма позволяет проводить дальнейшую работу по генетической классификации семейства Орхидные.
Литература
1. Вахрамеева направления изучения орхидных природной флоры России / , , // материалы международной научной конференции, Киев, 1999
2. Кочиева маркирование сортов баклажанов (Solanum melongena L.) // Сельскохозяйственная биотехнология. Под. ред. 2000. т. 1. С. 17 — 24
3. Дрейпер Дж. Генная инженерия растений: Лабораторное руководство. [Пер. с англ.]/ Дрейпер Дж., Р. Скотт, Ф. Армитидж, Р. Уолден // М.: Мир, 1991. 408 с.
4. М,. Н, Иванников тропических и субтропических растений in vitro. //Киев: Наукова думка, 2008. 560 с.
