Лабораторная работа № 3
Количественное определение ДНК в животных тканях
Цель – определить количество (мг% фосфора) ДНК в животной ткани.
Количественное определение ДНК проводится по методу Шмидта - Таннгаузера в модификации и . Принцип метода основан на том, что при добавлении к обработанной щелочью ткани насыщенного раствора NaCl в уксусной кислоте белки выпадают в осадок, а ДНК и другие фосфорные соединения остаются в растворе. ДНК отделяют от других фосфорных соединений путем осаждения ее спиртом и промывания осадка трихлоруксусной кислотой. Количество ДНК в тканях определяют по фосфору, по углеводному компоненту, либо используют свойство нуклеиновых кислот – специфическое поглощение ультрафиолетовых лучей. Определение по фосфору считается надежным методом оценки количества нуклеиновых кислот, так как его процентное содержание в наименьшей степени зависит от нуклеотидного состава: для ДНК оно составляет 9,8-10,1%, для РНК – 9,1-9,6%. При определении фосфора нуклеиновых кислот в тканях необходимо также предварительно удалить свободные нуклеотиды, неорганический фосфат, а также все фосфорсодержащие соединения ненуклеотидной природы, в частности липиды.
Материал исследования и реактивы: | Оборудование: |
1. Печень | 1. Центрифуга |
2. Натр едкий, 1н. раствор | 2. Фотоэлектроколориметр КФК - 2 |
3. Натр едкий, 30% раствор | 3. Кюветы с рабочей длиной 10 мм |
4. Натрия хлорид, насыщенный раствор в 20% уксусной кислоте | 4. Пробирки центрифужные |
5. Стеклянные палочки | |
5. Спирт этиловый | 6. Жаростойкая пробирка |
6. Трихлоруксусная кислота, 5% раствор | 7. Конические колбы на 25 и 50 мл |
8. Колбы мерные на 50 мл | |
7. Серная кислота, конц. | 9. Пробирки или цилиндры, градуированные на 10 мл |
8. Перекись водорода, 30% раствор | 10. Стаканы со льдом |
9. Аммоний молибденовокислый, 5% раствор в серной кислоте | 11. Пипетки на 10 мл |
12. Автоматические пипетки | |
10. Гидрохинон | 13. Универсальный индикатор |
11. Карбонат-сульфитная смесь | 14. Весы |
12. Стандартные растворы фосфорнокислого однозамещенного калия для количественного определения ДНК | 15. Водяная баня |
16. Ледяная баня | |
13. Лед |
Ход работы. 1. Обработка ткани печени щелочью.
Навеску ткани печени в 100 мг помещают в центрифужную пробирку с 1 мл 1н. NаОН и ставят в кипящую водяную баню на 15 мин. Периодически содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой. В течение этого времени ткань полностью растворяется (получившаяся жидкость представляет собой прозрачный или слегка опалесцирующий раствор).
2. Последовательное осаждение белков и ДНК. Пробу охлаждают при комнатной температуре, а затем при 0°С (лед). К охлажденной пробе добавляют 0,5 мл насыщенного раствора NaС1 в 20% СН3СООН, при этом белки выпадают в осадок. Через 3 - 5 мин после добавления реактива пробу центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.
Центрифугат сливают в центрифужную пробирку, находящуюся во льду, в которую налито 6 мл этилового спирта; при этом ДНК выпадает в осадок, а РНК и другие фосфорные соединения остаются в спиртовом растворе. Для более полного выделения ДНК осадок белка, полученный после центрифугирования, вновь растворяют в 1 мл 1 н. NаОН (на холоду) и сразу же осаждают 0,5 мл насыщенного раствора NaС1 в 20% СН3СООН. Пробу центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, и полученный центрифугат присоединяют к первому (находящемуся в спирте), а осадок отбрасывают. Содержимое пробирки (спирт + центрифугаты) тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на холоду в течение 1 ч для полного осаждения ДНК.
Через 1 ч содержимое пробирок центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин; центрифугат сливают, а осадок ДНК дважды отмывают 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты.
Содержание ДНК определяют по фосфору (метод Фиске - Субарроу):
3. Определение ДНК по фосфору. Метод основан на определении количества фосфора, входящего в состав ДНК, который выделяется в свободном виде в результате сжигания (минерализации) ДНК. В получившемся минерализате фосфор определяют колориметрическим методом по реакции его с молибдатом аммония в присутствии восстановителя. Продукт реакции - молибденовая синь - дает окрашенные в синий цвет растворы, интенсивность окраски которых прямо пропорциональна количеству фосфора в пробе.
Отмытый трихлоруксусной кислотой осадок ДНК количественно переносят в жаростойкую пробирку (колбу), добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и, укрепив пробирку слегка наклонно, осторожно нагревают раствор на плитке, до тех пор пока раствор в пробирке приобретет бурую окраску (если органического вещества в пробе мало, то побурения можно не заметить). После этого пробирку охлаждают, добавляют 1 каплю 30% раствора перекиси водорода и раствор снова нагревают в течение 5 -10 мин. Если раствор при этом побуреет, добавляют новую порцию перекиси. При добавлении перекиси следят за тем, чтобы она попала не на стенки пробирки. Нагрев при минерализации не должен быть слишком сильным, нельзя допускать, чтобы тяжелые пары серной кислоты и оксида серы выходили из пробирки, так как вместе с ними может частично увлекаться фосфат. Минерализацию проводят в пробирках, прикрытых маленькими воронками, которые вставляют, когда вода почти испарится. Минерализацию проводят до полного просветления жидкости. Одновременно с анализируемыми пробами минерализацию проводят в контрольной «слепой» пробе, содержащей вместо исследуемого раствора воду. Необходимость контроля обусловлена тем, что используемые при минерализации реактивы могут содержать следы фосфорной, а также кремневой кислот, присутствие которых может завысить результаты при определении общего фосфора.
После окончания минерализации жидкость из пробирки количественно переносят в мерную колбу на 50 мл, осторожно добавляя первые порции воды (происходит сильное разогревание!) и тщательно ополаскивая пробирку водой. Затем доводят реакцию среды до нейтральной (по универсальному индикатору) добавлением 30% раствора NаОН и доводят объем жидкости дистиллированной водой до метки.
Из колбы отбирают 5 мл жидкости, переносят в градуированную пробирку (мерный цилиндр) на 10 мл, добавляют 0,5 мл 5% раствора молибдата аммония и 0,5 мл 1% раствора гидрохинона. Через 5 мин к содержимому пробирки добавляют 2 мл карбонат-сульфитной смеси и доводят водой до 10 мл.
Через 10 мин определяют оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре, используя красный светофильтр (625-650 нм). По величине оптической плотности устанавливают количество фосфора в пробе, имея предварительно построенный график зависимости оптической плотности от концентрации фосфора.
Для построения калибровочной кривой используют стандартные растворы КН2РО4, содержащие 1, 2, 3, 4 мкг фосфора в 1 мл. На оси абсцисс откладывают значение концентраций стандартных растворов, а на оси ординат - соответствующие им оптические плотности (рис. 1). Содержание ДНК выражают в миллиграммпроцентах фосфора. В норме содержание ДНК в печени крысы равно 25 - 35 мг%; фосфора.
Рис.1 Кривая зависимости оптической плотности от концентрации фосфора
