Лабораторная работа № 4
Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке по методу Мюллера и Зейферта
Распад нуклеиновых кислот и их мономеров до конечных продуктов можно выразить следующей схемой:
Нуклеиновые кислоты→нуклеотиды→
пурины, пиримидины→мочевая кислота, β-аланин и аммиак
О состоянии нуклеинового и нуклеотидного обмена судят по активности ферментов, участвующих на разных стадиях их распада и превращения, а также по содержанию мочевой кислоты – конечного продукта обмена пуриновых оснований.
Цель – изучить обмен нуклеиновых кислот и нуклеотидов.
Реактивы. Реактив Фолина*; трихлоруксусная кислота, 20%-иый раствор; карбонат натрия, насыщенный раствор; мочевая кислота, стандартный раствор 0,02 мг/мл, свежеприготовленный.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; КФК.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации данной кислоты.
Ход определения. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, дистиллированной воды и трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, через 5 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин.
Берут две чистые градуированные пробирки — опытную и стандартную, добавляют в них реактивы в соответствии с таблицей.
Реактив | Опыт | Стандарт |
Цснтрифугат, соответствующий 0,5 мл сыворотки | 1,5мл | - |
Стандартный раствор мочевой кислоты | - | 0,5мл |
Трихлоруксусиая кислота | - | 0,5мл |
Дистиллированная вода | - | 0,5мл |
Насыщенный раствор карбоната натрия | 0,7мл | 0,7мл |
Реактив Фолина (осторожно!) | 1 капля | 1 капля |
Через 10 мин обе пробы фотометрируют против воды на КФК при 510-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.
Расчет проводят по формуле:
х=(Еоп ·0,01·2000)/Ест·168
где х - содержание мочевой кислоты в сыворотке крови, ммоль/л; Еоп - экстинкция опытной пробы; Ест - экстинкция стандартной пробы; 0,01 - масса мочевой кислоты в пробе стандартного раствора, взятого для реакции, мг; 2000 - коэффициент пересчета на 1л сыворотки крови; 168 - молекулярная масса мочевой кислоты.
Оформление работы. Рассчитать содержание мочевой кислоты в сыворотке крови и сделать вывод о возможных изменениях пуринового обмена.
Практическое значение работы. В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,10-0,40 ммоль/л, а с мочой выделяется 2,36-5,9 ммоль/сут. Повышенное содержание мочевой кислоты наблюдается в крови и моче при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеинов (лейкозах, диабете, аллергии и др.). Резко увеличивается концентрация мочевой кислоты при подагре, это сопровождается отложением солей мочевой кислоты в суставах и различных тканях организма. Понижение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и кортикотропина (АКТГ).
