ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАУ В БЕЛКОВЫХ СРЕДАХ НА ФЛУОРИМЕТРЕ ОРИГИНАЛЬНОЙ КОНСТРУКЦИИ
, ,
Саратовский государственный технический университет
имени
E-mail: *****@***ru
Многие представители полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) являются общепризнанными экотоксикантами, проявляющими канцерогенные и мутагенные свойства [1]. Их содержание в окружающей среде должно обязательно контролироваться. Попадая в организм, они способны связываться с сывороточными альбуминами крови. Важным свойством сывороточных альбуминов является связывание и транспортирование различных лигандов к органам и тканям [2]. Однако некоторые вещества, попадая в организм, способны воздействовать на структуру белков и приводить к развитию различных заболеваний [3]. Ряд веществ при взаимодействии с сывороточными альбуминами могут вызывать конформационные изменения белковых макромолекул [4], к таким веществам относятся и ПАУ [5].
В связи с этим актуальным для современной медицины и биотехнологии является исследования взаимодействия ПАУ с белковыми макромолекулами, а также разработка эффективных методов определения данных экотоксикантов в различных средах и соответствующего аппаратурного обеспечения для реализации указанных задач.
В работе предлагается метод определения ПАУ в сывороточном альбумине человека (САЧ) и бычьем сывороточном альбумине (БСА). Метод основан на тушении флуоресценции белковых макромолекул при связывании с ПАУ, а также на регистрации собственной флуоресценции молекул ПАУ. В качестве представителей ПАУ применялись пирен и антрацен. В работе использовались растворы БСА и САЧ (Sigma, США, 99% основного вещества) с концентрацией С = 1 мг/мл в фосфатном буфере, концентрацией 0.15 М, содержащем Na2HPO4 – KH2PO4 (рН 7.4).
При введении в растворы сывороточных альбуминов ПАУ наблюдалось общее снижение интенсивности флуоресценции белков, что свидетельствует о взаимодействии ПАУ с белками. Из литературных источников известно, что при этом в стабилизации комплекса ПАУ-белок значительную роль играют Ван-дер-ваальсовы силы межмолекулярного взаимодействия и водородные связи [5].
Основными флуоресцирующими группами в белках являются ароматические остатки триптофана, тирозина, фенилаланина, причем доминирующим флуоресцирующим компонентом в большинстве белков является триптофанильный остаток. Триптофановая флуоресценция альбуминов регистрировалась в диапазоне 300-500 нм при возбуждении светом с длиной волны 280 нм. Интенсивность собственной флуоресценции САЧ тушится более эффективно, чем БСА, при тех же концентрациях тушителя. Это объясняется разностью структуры данных белков, а именно наличием в БСА двух остатков триптофановой кислоты. В случае использования пирена наблюдалось более эффективное тушение флуоресценции САЧ и БСА по сравнению с антраценом.
Следующим этапом работы было изучение спектров флуоресценции пирена и антрацена в САЧ и БСА. Спектр флуоресценции пирена регистрировался в диапазоне 350-450 (500) нм при возбуждении светом с длиной волны 334 нм. Спектр флуоресценции антрацена регистрировался в диапазоне 370-500 нм при возбуждении светом с длиной волны 353 нм. Зависимость интенсивности флуоресценции ПАУ от их концентрации в белках имеет линейный характер. При этом угловой коэффициент градуировочного графика пирена значительно больше, чем у антрацена, что свидетельствует о большей чувствительности определения пирена данным флуоресцентным методом по сравнению с антраценом.
Для экспресного анализа ПАУ в белковых средах был создан портативный импульсный флуориметр, позволяющий регистрировать интенсивность флуоресценции зондов. Источником служила газоразрядная импульсная лампа, исследуемый образец помещался в специальное кюветное отделение, флуоресценция образца регистрировалась фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). Для повышения чувствительности прибора, ФЭУ применено электронное запирание. Выделение длины волны возбуждения и регистрации зондов осуществлялось с помощью специально подобранных светофильтров. Разработанный блок синхронизации осуществлял работу прибора в автоматическом режиме. Выход ФЭУ и согласующей схемы через АЦП подключен к блоку обработки и визуализации информации, в качестве которого может быть использован персональный компьютер.
Предложенный метод и приборное обеспечение позволяют определить содержание ПАУ в белках за короткое время, определяемое только помещением пробы в кюветное отделение, и могут с успехом использоваться в диагностических центрах и медицинских учреждениях.
Библиографический список
1. Skupinska K., Misiewicz I., Kasprzycka-Guttman T. Polycyclic aromatic hydrocarbons: physicochemical properties, environmental appearance and impact on living organisms. // Acta Pol. Pharm. 2004. V. 61. № 3. P. 233-240.
2. Fasano M., Curry S., Terreno E. et al. The extraordinary ligand binding properties of human serum albumin// IUBMB Life. 2005. V. 57. № 12. P. 787-796.
3. Arroyo V., Garcia-Martinez R., Salvatella X. Human serum albumin, systemic inflammation, and cirrhosis.// Journal of Hepatology. 2014. V. 61. № 2. P. 396-407.
4. Chen R., Jiang H., Pu H. Interaction of artemisinin and its derivatives with human serum albumin studied using spectroscopies and molecular modeling methods.// Mol. Biol. Rep. 2013. V. 40. № 8. P. 4791-4804.
5. Xu C., Gu J., Ma X. et al. Investigation on the interaction of pyrene with bovine serum albumin using spectroscopic methods.// Spectrochim. Acta. Part A. Mol. Biomol. Spectrosc. 2014. V. 125. P. 391-395.
Сведения об авторах
Плотникова Ольга Александровна – к.х.н., доцент, дата рождения: 05.02.1981г
Мельников Андрей Геннадьевич – к. ф.-м. н., доцент, г
– д. х.н., профессор, г
Вид доклада: стендовый
