Определение жизнеспособности клеточных культур

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Нижегородский государственный университет им.

Национальный исследовательский университет

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией института биологии и биомедицины для студентов ННГУ, обучающихся по направлению 06.03.01 «Биология» (бакалавриат)

Нижний Новгород

2015

УДК 57.087.1

ББК Е60х73х715.3

М 36

М 36 , , ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР: Учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет им. , 2015. – 21 с.

Рецензент: д. б.н.,

Учебно-методическое пособие содержит краткие теоретические и практические сведения по выводу клеточных культур из консервации и методам определения жизнеспособности клеточных культур.

Руководство предназначено для студентов ННГУ, обучающихся по направлению 06.03.01 «Биология» в рамках курса «Экспериментальные методы клеточной нейробиологии» (бакалавриат).

Ответственный за выпуск:

председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ, д. п.н., профессор И. М. Швец

УДК 57.087.1

ББК Е60х73х715.3

© Нижегородский государственный

университет им. , 2015

© , ,

, 2015

ВВЕДЕНИЕ

В современной клеточной биологии и цитологии зачастую требуется оценить комплекс параметров, характеризующих жизнеспособность различных типов клеточных популяций. Определение жизнеспособности клеток необходимо для оценки их морфологической целостности, например, после вывода клеточной линии из криоконсервации, а также для изучения влияния различных видов воздействия (различных условий культивирования, действия токсинов, фармакологических препаратов, различных патогенных факторов и т. д.) на клетку.

Под жизнеспособностью клеток понимают способность клеток поддерживать состояние, необходимое для выполнения ими специфических функций, так и возможность реализации митотического потенциала клетками, способными к делению (Герасимов, Попандопуло, 2007). Существует несколько различных методов, позволяющих оценить жизнеспособность клеточной культуры или образца ткани, применяющихся в зависимости от конкретной задачи исследования. Их можно условно разделить на следующие группы:

1. Оценка целостности морфологической структуры клеток (неспецифическая оценка жизнеспособности).

2. Оценка метаболической активности клеток.

3. Оценка пролиферативной активности.

4. Оценка функциональной активности клеток in vitro.

В настоящем пособии мы будем рассматривать первые две группы методов оценки жизнеспособности.

1. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С КУЛЬТУРОЙ КЛЕТОК

1.1. Преимущества метода

Клеточные культуры в качестве объекта исследования имеют свои особенности использования, преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при планировании исследований. Культивирование клеток in vitro – это методика, с помощью которой отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот или эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях (заданные температура, влажность, газовый состав среды). На практике термин «культура клеток» обычно употребляется в отношении выращивания клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных.

К преимуществам использования клеточных культур можно отнести следующие:

1. Одно из основных преимуществ культивируемых клеток – это возможность прижизненного хронического наблюдения за клетками с помощью микроскопа.

2. При работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые, функционально полноценные клетки, сохраняющие свою жизнеспособность в течение всего эксперимента. При опытах на целом животном состояние печени, например, можно оценить лишь в конце эксперимента, и к тому же обычно лишь качественно.

Выделяют первичные клеточные культуры и постоянные клеточные линии. Первичные культуры – это клетки, получаемые непосредственно от животного и поддерживаемые в культуре до первого пассажа (пересева). Для получения первичных культур производят стерильное выделение выбранной для эксперимента ткани животного, которую механически или ферментативно диссоциируют, т. е. отделяют клетки друг от друга. Ткань может быть измельчена механическим путем до мелких фрагментов, которые в дальнейшем прикрепляются к поверхности культурального фалькона благодаря собственной способности к адгезии, наличию насечек на фальконе или с помощью сгустка плазмы. При осуществлении такого метода прикрепленные к субстрату клетки способны к делению и миграции из эксплантатов. Мигрировавшие клетки в дальнейшем можно пересевать или подвергать криозаморозке. Таким образом, в лабораторных условиях существует возможность получить и поддерживать жизнеспособность различных типов первичных культур (например, культуру клеток дермы – фибробластов). Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок культивирования. После завершения нескольких циклов деления, клетки в таких культурах стареют и прекращают делиться, не утратив при этом свою жизнеспособность.

Первичная культура может быть также получена путём дополнительной ферментативной диссоциации тканей, например, трипсином или коллагеназой. При инкубации ткани с ферментом происходит разрушение связей между клетками, клетки в среде образуют однородную суспензию, которую переносят в культуральные фальконы или на покровные стекла. Клетки оседают на поверхность субстрата, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или культурального пластика. При таком способе культивирования можно получить культуры клеток эпителия, некоторые эмбриональные культуры, в том числе нейрональные культуры различных отделов нервной системы (например, коры больших полушарий, гиппокампа или мозжечка).

Постоянные (непрерывные) клеточные линии представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Это клетки, способные культивироваться вне организма в течение неограниченного количества пассажей. Все культуры с неограниченной способностью к размножению («бессмертные культуры») следует называть постоянными (непрерывными) или стабильными линиями. В вирусологии широко применяется термин «перевиваемые линии клеток», под которым понимается линия клеток, способная к бесконечному (неограниченному) росту вне организма. У большинства опухолевых клеток эта способность является результатом случайной мутации, но у некоторых лабораторных клеточных линий она формируется искусственно, путем активации гена теломеразы, т. е. такие клетки «иммортализированы».

Еще одним значимым преимуществом использования клеточных культур является возможность изменения условий культивирования в определённых пределах, что позволяет оценивать влияние самых различных факторов (рН, температуры, газового состава, различных фармакологических воздействий и др.) на жизнеспособность клеток. Поэтому культуры клеток эффективно применяют для изучения тонких молекулярных механизмов различных физиологических процессов и моделирования различных патологических состояний (например, гипоксии).

Клеточные культуры являются оптимальной моделью для исследования действия различных веществ на метаболизм клеток как в остром, так и в хроническом эксперименте. Аппликация блокаторов различных рецепторов, ионных каналов, токсинов, гормонов и прочих веществ в культуральную среду может быть осуществлена в требуемой концентрации и на заданный период времени. Кроме того, культивирование клеток in vitro позволяет нивелировать риск того, что исследуемое соединение метаболизируется печенью, будет запасено мышцами или выведено почками.

Для корректной постановки экспериментов необходимо учитывать следующие особенности клеточных культур:

1) в случае постоянных клеточных линий:

а) однородность клеток, обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками;

б) отсутствие структурной организации культуры, гистологическая однородность и связанные с ней биохимические признаки;

в) интенсивное размножение клеток с большим выходом биомассы;

г) возможность клонирования, селекции, получения чистых клеточных линий, изучения или видоизменения свойств клеток и закрепление этих свойств;

2) в случае первичных клеточных культур:

а) чаще всего первичные клеточные культуры готовят из эмбриональной ткани животных либо человека, поскольку эмбриональные клетки обладают повышенной способностью к росту и размножению;

б) достаточно часто используют смешанные культуры из нескольких типов клеток или нескольких тканей.

1.2. Особенности первичных культур нервных клеток

Для исследования функциональной активности на сетевом и клеточном уровне одной из наиболее удобных моделей являются первичные культуры различных отделов мозга. Кроме того, с использованием генноинженерных технологий в первичную культуру можно осуществить внесение генов флуоресцентных белков, что позволяет визуализировать различные клеточные структуры и процессы, происходящие на разных уровнях организации нейронных сетей. Также внесение в клетку оптогенетически активируемых ионных каналов позволяет регулировать активность нервных клеток и изучать тонкие молекулярные механизмы их функционирования.

Первичные культуры имеют клеточный состав, характерный для выбранного для исследований участка мозга. Развитие культуры происходит в соответствии с генетически детерминированными программами, при этом особенности развития зависят от плотности культуры, клеточного состава и частично условий культивирования (состав культуральной среды). Первичные культуры являются относительно простыми и удобными системами, с использованием которых возможно проводить долговременные исследования их морфологических и функциональных особенностей. Изолированные и развивающиеся in vitro нервные и глиальные клетки являются практически идеальной экспериментальной моделью для решения разнообразных фундаментальных задач в области нейробиологии (Анохин, 2002, Лебедев, Бурцев, 2010). В связи с вышеизложенным в последние годы исследования с использованием первичных культур нервной системы заняло ведущее место в нейробиологических исследованиях.

1.3. Работа в культуральной лаборатории

Традиционно лаборатория, где проводят работы с культурами клеток, включает в себя минимум три помещения. Это бокс, где проводятся стерильные работы; комната для приготовления питательных сред, хранения реактивов, оборудования, проведения фиксации и окрашивания препаратов и т. д.; автоклавная. На сегодняшний день современные модели автоклавов и сухожаровых шкафов стали более надежными и безопасными в использовании и отдельных комнат для их размещения не требуется, они могут находится в комнате для хранения реактивов и посуды. Часто отдельно размещают моечную комнату.

Подготовка стерильного бокса к работе

Различные манипуляции с культурами клеток проводят в специальном помещении – стерильном боксе. В нем соблюдаются особые условия режима работы. Полы и стены этого помещения должны быть легко моющимися (желательно кафельными) и не содержать материалов, накапливающих пыль. Влажную уборку проводят с использованием дезинфицирующих агентов. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинарного шкафа (специальный шкаф с находящейся внутри него стерильной рабочей зоной) облучают УФ-лучами в течение 30-45 минут.

При длительном воздействии ультрафиолет вызывает гибель всех бактерий. Бактерии погибают достаточно быстро, а споры грибов сохраняют жизнеспособность значительно дольше. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы различных моделей, которые включаются на 30-45 минут в зависимости от конкретной модели за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Непосредственно перед началом работы необходимо протереть внутренние поверхности ламинарного шкафа 70% этиловым спиртом, разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, пинцеты, пипетки, культуральную посуду, реактивы. Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересевом клеточных культур проводят в ламинарных шкафах.

Асептические условия в ламинаре создаются с помощью отсекающего потока воздуха. Ток воздуха, проходя через хепа-фильтры ламинара, движется к исследователю, что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов и предотвращать внесение новых.

При работе с культурами животных клеток требования к соблюдению стерильности более жесткие по сравнению с растительными культурами, поскольку вероятность контаминации выше.

Не рекомендуется в одних и тех же боксах вести работы с микробиологическими объектами и культурами эукариотических клеток. Микроорганизмы более устойчивы к внешним факторам, и простерилизовать после работы с ними помещение гораздо труднее.

Все изложенное выше касается работ с непатогенным материалом. Уровни защиты при работе с патогенным материалом иные, и они требуют обеспечения большей биологической безопасности.

При работе в стерильном помещении лаборатории все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений:

Правила работы в культуральном боксе

1. Все лица, находящиеся в лаборатории, должны быть в халатах, сменной обуви (либо бахилах), шапочке или косынке, перчатках, маске.

2. В помещении запрещается прием пищи и курение, хранение продуктов питания.

3. Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

4. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнюю одежду на халат.

5. Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все стерильные работы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т. п.

6. Нужно строго следить за чистотой рук: руки в перчатках периодически обрабатываются 70% спиртом, по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют.

7. Весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или уничтожению.

2. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

Поскольку постоянно поддерживать жизнеспособность клеточных линий в инкубаторе зачастую является затруднительным, широко применяется практика криоконсервации клеток с последующим выводом их из криоконсервации для проведения конкретных исследований. Криоконсервация – это заморозка биологических объектов для последующего их хранения. Объекты при этом остаются живыми и после разморозки способны восстановить свои функции в полном объеме. Криоконсервации подвергаются как прокариотические, так и эукариотические клетки: бактерии, культуры животных клеток, эмбрионы, сперма, кровь. Метод криоконсервации широко применяется в науке и клинической практике. Заморозку живых объектов проводят, как правило, в жидком азоте при температуре –196оС или специальных морозильных камерах при –143оС.

При замерзании вода в цитоплазме клеток формирует кристаллы льда, которые разрушают клеточные мембраны. Таким образом, для проведения успешной заморозки с сохранением жизнеспособности клеток после криоконсервации используют среды, содержащие специальные вещества – криопротекторы. Криопротекторы защищают клетки от повреждений и разрушений при заморозке и последующем оттаивании. После разморозки биологических объектов криопротекторы должны быть выведены из клеток. Для подготовки бактериальных и эукариотических клеток к криоконсервации, их помещают в специальные питательные среды – криосреды. В качестве криопротектора в таких средах используется глицерин или диметилсульфоксид (ДМСО), также иногда применяется этиленгликоль. Для каждой клеточной линии существует так называемый «паспорт культуры», в котором указаны основные параметры культивирования – тип культуральной среды, тип среды для криоконсервации, особенности пересевания. При выборе сред и дальнейшем культивировании необходимо руководствоваться данными, указанными в паспорте культуры. Также важно учитывать, что криоконсервацию проводят в несколько этапов, постепенно понижая температуру. Это позволяет максимально щадяще заменить воду, содержащуюся в цитоплазме клеток, на криопротектор. Напротив, вывод клеток из криоконсервации проводится быстро и в один этап. При этом среды для вывода клеток из криоконсервации содержат увеличенное количество эмбриональной сыворотки, что поддерживает жизнеспособность клеток.

Лабораторная работа №1

Выведение клеточной линии Chang liver из криоконсервации

Цель: вывести клетки требуемой клеточной линии из криоконсервации с целью дальнейшего их культивирования для проведения исследований in vitro.

Материалы и оборудование: культуральная среда Игла МЕМ с солями Эрла, L-глутамин, телячья эмбриональная сыворотка, пробирка с замороженными клетками линии Chang liver, культуральные фальконы, центрифуга, дозаторы биохимические, пробирки стерильные центрифужные, спиртовка.

1. Одеть средства индивидуальной защиты (стерильный хирургический костюм, перчатки, маску).

2. Приготовить культуральную среду, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки путем добавления сыворотки в стандартную среду, используемую для культивирования выбранной клеточной линии согласно паспорту клеточной культуры. Для линии печени человека Chang liver такой средой является среда Игла МЕM. В стандартную промышленную среду необходимо добавить L-глутамин согласно рекомендации производителя. Ростовую среду прогреть до 370С на водяной бане или в условиях инкубатора.

3. Извлечь из криохранилища пробирку с клеточной линией, поместить ее в ламинарном шкафу в стаканчик с теплой водой (36-380С). Дальнейшую работу проводить в ламинарном шкафу.

4. После того как лед в криопробирке полностью растает, пробирку быстро обтереть спиртом, горлышко пробирки обжечь с помощью спиртовки.

5. Пробирку открыть и все содержимое пробирки перенести в стерильную центрифужную пробирку с крышкой, содержащую 12 мл прогретой культуральной среды с 20% сыворотки.

6. Пробирку с ростовой средой и находящимися в ней клетками центрифугировать при скорости 800 оборотов в минуту, в течение 3 минут.

7. Удалить надосадочную жидкость полностью. Осадок ресуспензировать в 1 мл культуральной среды.

8. Определить количество клеток в суспензии с помощью автоматического цитометра или камеры Горяева (см. лабораторную работу № 2).

9. Культуральную среду с ресуспензированными в ней клетками перенести в культуральный планшет, добавить культуральную среду в соответствии с объемом выбранного типа планшета. Через 5-6 часов визуально оценивают плотность прикрепившихся к поверхности планшета клеток с помощью световой микроскопии.

10. Через 24 часа оценивают жизнеспособность клеток, прикрепившихся ко дну лунки.

Контрольные вопросы

1.  Для чего в состав среды для криоконсервации входят криопротекторы?

2.  При каких температурах хранятся замороженные культуры эукариотических клеток?

3.  Требуются ли особые среды для вывода клеток из криоконсервации?

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

Методы неспецифичной оценки жизнеспособности клеточных культур предполагают визуализацию и распознавание клеток после окраски их специфическими красителями, которые проникают внутрь клетки только при повреждении её оболочки. Таким образом, окрашенные клетки признаются не жизнеспособными. Результаты окрашивания оцениваются либо при помощи микроскопии и визуального подсчета доли мертвых клеток относительно общего их числа, либо с помощью проточной цитофлуориметрии. Наиболее распространенным красителем является трипановый синий, проникающий только в погибшие клетки. Также широко распространено применение флуоресцентного красителя пропидиум иодида.

Более сложные и точные методики оценки жизнеспособности заключаются в определении возможности клеток осуществлять свои функции. Для этого в культурах клеток оценивают уровень содержания специфических веществ, которые вырабатываются клетками в нормальном состоянии. Снижение концентрации этих веществ указывает на то, что внешне неповреждённая клетка может оказаться функционально неполноценной, то есть не жизнеспособной.

Лабораторная работа №2

Определение жизнеспособности клеток с помощью окрашивания трипановым синим

Принцип метода. Трипановый синий – кислый анилиновый краситель, используемый для селективного окрашивания мертвых клеток и тканей. Впервые был синтезирован Паулем Эрлихом в 1904 году. Этот краситель не способен проникнуть в клетку через неповрежденную клеточную мембрану, поэтому живые клетки им не окрашиваются. При повреждении мембраны трипановый синий окрашивает клеточное ядро в интенсивно синий цвет. Окрашенные клетки считаются мертвыми.

Материалы и оборудование: Трипановый синий; фосфатно-солевой буферный раствор; пробирки типа Eppendorf; стерильные наконечники; дозаторы, камера Горяева, световой микроскоп.

Ход исследования

1. Приготовить рабочий 0,2-0,4%-ный раствор трипанового синего в изотоническом солевом растворе (фосфатно-солевой буферный раствор или физиологический раствор).

2. Если процедура учета жизнеспособности проводится при пересевании клеток, то сначала следует перевести клетки в суспензию. Если проводится оценка жизнеспособности прикрепленных клеток, то раствор красителя вносится непосредственно в культуральную среду.

3. Добавить 0,1 мл раствора трипанового синего к 1 мл клеток или культуральной среды.

4. Клетки инкубируют с красителем 10 минут при 37°С и подсчитывают в камере Горяева процент окрашенных клеток (мертвых) от общего количества клеточных элементов. Либо проводят учет количества клеток в поле зрения с прикрепленной культуры непосредственно на стекле.

Посчитать количество окрашенных в синий цвет (Nc. к.) клеток и общее количество клеток (Nобщ). Для здоровых культур жизнеспособность клеток (% Nж. к.) должна составлять не менее 95% от общего числа клеток в культуре.

Подсчет клеток с помощью счетной камеры

Существует несколько типов камер, предназначенных для учета количества клеток на единицу объема. Один из наиболее часто используемых – камера Горяева. Данная камера представляет собой предметное стекло с нанесенными на него бороздами и микроскопической сеткой (рис. 1).

Размеры малых квадратов сетки составляют 0,05 мм, размеры больших квадратов – 0,2 мм. Сетка нанесена на площадку (участок стекла), расположенную на 0,1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. В результате в камеру заливается точный фиксированный объем жидкости. Объем над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0,004 микролитра.

А.

Б. В.

Рисунок 1. Строение счетной камеры Горяева: А, Б – общий вид, В – сетка для подсчета клеток

Подсчитав количество клеток над ним, можно подсчитать число данного типа клеток в суспензии по формуле:

Количество клеток/мл = количество клеток над большим квадратом * 2,5·105

Ход работы

1. Протереть и обезжирить счетную камеру с помощью сухой фильтровальной бумаги или смоченной спиртом марли и высушить на воздухе. Тщательно притереть покровное стекло в камере Горяева до появления цветных концентрических дифракционных колец (ньютоновские кольца).

2. Подготовить клеточную суспензию, окрашенную трипановым синим по приведенному выше протоколу. Развести клетки фосфатно-солевым буферным раствором до желаемого объема. Клеточная суспензия должна быть разбавлена таким образом, чтобы клетки было легко подсчитать. Однако при разведении следует учесть, что количество клеток должно быть достаточным для получения достоверного результата. Перед забором нужного объема, клетки необходимо хорошо ресуспензировать. Скоплений клеток в растворе не допускается.

3. Нанести суспензию клеток пастеровской пипеткой или дозатором (15 мкл суспензии) к краю покровного стекла. Камера под покровным стеклом наполнится под действием капиллярных сил. Жидкость не должна выступать из-под покровного стекла. В камере, заполненной суспензией, не должно быть пыли или пузырьков воздуха.

4. Подсчитать клетки, которые находятся в больших квадратах или если они находятся на пересечении верхней или правой границы квадрата. Клетки, которые находятся на нижней и левой границе квадрата, не учитываются. Клетки подсчитываются под световым микроскопом с использованием соответствующих увеличений. Общее количество подсчитанных больших квадратов - 25.

Контрольные вопросы

1. Объясните принцип метода оценки жизнеспособности клеток трипановым синим.

2. Как осуществляется подсчет клеток в камере Горяева?

3. Какие выводы можно сделать о морфофункциональном состоянии экспериментальной культуры, если при подсчете клеток ее жизнеспособность составила 75%?

Лабораторная работа №3

Определение жизнеспособности клеток с помощью окрашивания пропидиум иодидом и бисбензимидом

Принцип метода. Метод оценки жизнеспособности культур с помощью окрашивания пропидиум иодидом и бисбензимидом основывается на одновременном применении двух красителей. Для осуществления данной методики лаборатория должна быть оснащена специальным оборудованием – флуоресцентным микроскопом или проточным цитофлуориметром.

Бисбензимид (Hoechst 33342) – флуоресцентный краситель, специфически связывающийся с ДНК, и возбуждаемый ультрафиолетом. Максимум поглощения бисбензимида – 361 нм, максимум испускания флуоресценции находится в синей области от 460 до 490 нм (max 486 нм). Данный краситель способен проникать сквозь плазматическую мембрану и окрашивать ДНК, содержащуюся как в живых, так и в погибших клетках. Бисбинзимид связывается преимущественно с участками ДНК, содержащими значительное число пар аденин-тимин (AT) оснований. Флуоресценция бисбензимида может эффективно возбуждаться УФ спектральными линиями аргоновых лазеров, ксеноновых или ртутных ламп и обнаружены с помощью фильтров для DAPI или синих GFP фильтров (фильтры пропускания синего света). Бисбензимид (Hoechst 33342) имеет относительно большой сдвиг Стокса (разница длин волн максимумов спектров поглощения и испускания флуоресценции), что делает его пригодным для многоцветного окрашивания препаратов в комбинации с зелеными, желтыми и красными флуорофорами.

Hoechst 33342 может быть добавлен непосредственно в культуру клеток после разбавления его до рабочей концентрации в культуральной среде или сбалансированных солевых растворах. Ядра окрашиваются в синий цвет и могут быть четко визуализированы как с последующей промывкой культуры от красителя, так и без нее (рис. 2).

А.Б. В.

Рисунок 2. Окрашивание клеточной культура на жизнеспособность:

А – световая микроскопия, Б – окрашивание бисбензимидом, В – окрашивание пропидиум иодидом

Оптимальная концентрация бисбензимида для окрашивания ДНК изменяется для различных типов клеток и должна быть подобрана для каждого конкретного эксперимента. Время инкубации с красителем зависит от типа клеток, и, как правило, находится в пределах от 5 до 30 минут при комнатной температуре или при 37° С. Интенсивность флуоресценции может увеличиваться со временем, если образцы исследуются без промывки.

Пропидиум иодид – краситель, окрашивающий ДНК только мертвых клеток, поскольку неспособен проникать через неповрежденную цитоплазматическую мембрану. После того, как пропидиум иодид связывается с нуклеиновой кислотой, интенсивность его флуоресценции усиливается в 20-30 раз, максимум возбуждения - 535 нм и максимум излучения регистрируется при 617 нм.

Пропидиум иодид (PI) широко используется в флуоресцентной микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, проточной цитометрии.

Материалы и оборудование: бисбензимид, пропидиум иодид, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), флуоресцентный микроскоп.

Ход работы

1. Приготовить рабочие растворы бисбензимида и пропидиум иодида в PBS.

Рабочая концентрация бисбензимида составляет 1 мг/мл.

Рабочая концентрация пропидиум иодида составляет 1 мг/мл.

2. Если определение жизнеспособности проводится непосредственно в живой, незафиксированной культуре, то рабочие растворы красителей следует добавлять в культуру клеток в таком количестве, чтобы получить итоговую концентрацию, определенную в ходе предварительных тестовых окрашиваний. Обычная концентрация для проверки составляет 1 мкг/мл.

3. Инкубировать экспериментальные культуры с введенными красителями при 37оС и 5% СО2 в течение 5-10 минут.

4. Провести подсчет клеток, окрашенных пропидиум иодидом и бисбензимидом. Для получения достоверных результатов подсчет клеток осуществляется как минимум в 10 полях зрения у каждой исследуемой культуры.

Количество живых клеток (Nж) рассчитывается как разница между количеством клеток, окрашенных бисбензимидом (Nbisbenzimide+), и клетками, окрашенными пропидиум иодидом (Npropidium iodide+), по следующей формуле:

Nж = (Nbisbenzimide+ - Npropidium iodide+/Nbisbenzimide+)*100%

5. Полученные результаты вносят в следующую форму:

Форма 1

Код исследования ____________________ Серия _______________________________ Дата _________________________________ Клеточная линия _____________________ Выведена из заморозки: _______________ Номер пассажа: _______________________ Введение исследуемой субстанции: ______
№ группы	№ культуры	Количество бисбензимид положительных клеток в культуре (общее число клеток)	Количество пропидиум иодид положительных клеток в культуре (число мертвых клеток)	% пропидиум иодид положительных клеток от общего числа клеток (% мертвых клеток в культуре)	Средний % живых клеток в группе (М±SD)
1.	1.
.......
2.	1.
.......

Контрольные вопросы

1. Объясните принцип метода оценки жизнеспособности клеток с помощью окрашивания пропидиум иодидом и бисбензимидом. По какой формуле рассчитывается жизнеспособность клеток в экспериментальной группе культур.

2. Какое оснащение требуется лаборатории для проведения метода оценки жизнеспособности клеточных культур пропидиум иодидом и бисбензимидом и почему.

3. Дайте краткую характеристику используемых в методике красителей (принцип действия, способ визуализации).

Лабораторная работа №4

Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста

Принцип метода. МТТ-анализ – колориметрический анализ для оценки жизнеспособности клеток. Метод основан на том, что митохондриальные дегидрогеназы способны преобразовывать водорастворимый синий 3(3,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, имеющий фиолетовый цвет, который кристаллизуется в цитоплазме клетки. С помощью органических растворителей (диметилсульфоксид или изопропанол) формазан переводится в растворенное состояние. По изменению оптической плотности раствора можно судить о количестве живых клеток.

Материалы и оборудование: раствор МТТ бромида, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), изопропанол-2, флуоресцентный микроскоп.

Ход работы

1. Одеть средства индивидуальной защиты (стерильный хирургический костюм, перчатки, маску).

2. Достать культуральный планшет с культурами клеток из СО2- инкубатора, поместить в ламинарный шкаф. Работу проводить в ламинарном шкафу.

3. Убрать при помощи дозатора культуральную среду из планшета.

4. Клетки промываются фосфатно-солевым буферным раствором.

5. В каждую ячейку внести по 300 мкл раствора МТТ бромида (концентрация 0,25 мг/мл в PBS).

6. Инкубировать экспериментальную культуру с красителем в условиях СО2-инкубатора в течение 30 минут.

7. Убрать раствор МТТ. Для разрушения клеточных мембран в каждую ячейку с культурами клеток добавляется изопропанол-2.

8. После 10-минутной инкубации культур с изопропанолом-2 проводится измерение оптической плотности на спектрофотометре при 570нм и 620 нм длинах волн.

9. Расчет результатов производят по формуле:

Е =А570-А620, где

Е – оптическая плотность

А570 – значение при длине волны 570 нм

А620 – значение при длине волны 620 нм

10. Количество жизнеспособных клеток (Nж, %) рассчитывается по следующей формуле:

Nж = Еопыта / Еконтроля*100%

10. При исследовании влияния субстанций (сыворотки крови и экстракта селезенки животных) за контроль принимают изменение оптической плотности культур с добавлением фосфатно-солевого буферного раствора.

11. Результаты представляются в таблице:

Таблица 1

Результаты определения МТТ-редуктазной активности

№ группы	№ культуры	% жизнеспособных клеток	Средний процент в группе (М±SD)
1	1
2
3
4
5
6
2	1
2
3
4
5
6

Контрольные вопросы

1. Объясните принцип метода оценки жизнеспособности клеток с помощью МТТ-редуктазного теста.

2. Как рассчитывается оптическая плотность в исследуемом образце?

3. Как рассчитывается жизнеспособность клеток при проведении МТТ-теста в экспериментальной группе культур?

Рекомендованная литература

1.  Фрешни животных клеток: практическое руководство. – М.: БИНОМ. Лаб-я знаний, 2012. 691 с.

2.  Биотехнология: теория и практика: Учебное пособие для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 020201 "Биология" / , , ; под ред. , . – Москва: Оникс, 2009. – 492 c.

3.  Электронный ресурс. Режим доступа: http://old. kpfu. ru/nilkto/cell/, свободный

4.  Электронный ресурс. Режим доступа: http://www. cytspb. rssi. ru/rkkk/rkkk_ru. htm, свободный

5.  Электронный ресурс. Режим доступа: http://www. sevin. ru/collections/cells. html, свободный

Содержание

Введение.............................................................................................................. 3

1. Особенности работы с культурой клеток...................................................... 4

1.1. Преимущества метода.................................................................................. 4

1.2. Особенности первичных культур нервных клеток..................................... 6

1.3. Работа в культуральной лаборатории........................................................ 6

2. Криоконсервация клеточных линий............................................................... 9

Лабораторная работа №1. Выведение клеточной линии Chang liver из криоконсервации.............................................................................................................................. 9

3. Определение жизнеспособности клеток в культуре.................................... 11

Лабораторная работа №2. Определение жизнеспособности клеток

с помощью окрашивания трипановым синим................................................. 11

Лабораторная работа №3. Определение жизнеспособности клеток

с помощью окрашивания пропидиум иодидом и бисбензимидом................. 14

Лабораторная работа №4. Определение жизнеспособности клеток

с помощью МТТ-теста...................................................................................... 17

Рекомендованная литература........................................................................... 19

Елена Владимировна Митрошина

Татьяна Александровна Мищенко

Мария Валерьевна Ведунова

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Учебно-методическое пособие

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Нижегородский государственный университет

им. ».

603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

Подписано в печать. Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.

Усл. печ. л. 1,25. Уч.-изд. л. .

Заказ № . Тираж 30 экз.

Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета

им.

603000, 7