Приложение
к Методологии анализа и качественной
оценки молока и молочных продуктов
Обнаружение лактозы в комбинированных кормах
1. Данный метод описывает процедуру определения лактозы в комбинированных кормах.
2. Под содержанием лактозы по данному методу понимается определенная массовая доля в процентном выражении.
Содержание безводной лактозы выражается в г/100 г.
3. Комбинированный корм реконструируется в воде. Раствор «Биггс» добавляется к разбавленной взвешенной аликвотной части для того, чтобы осел жир и белковые фракции комбинированного корма. Проба фильтруется (или центрифугируется), и профильтрованный продукт (или жидкая фракция) впрыскивается в колонку ВЭЖХ с катионитом (в виде свинца) вместе с водой, качество которой соответствует ВЭЖХ в качестве мобильной фазы. Вымытая лактоза определятся при помощи дифференциального рефрактометра.
За неимением других предписаний, используются исключительно реактивы соответствующего качества для проведения анализа, а также дегазированная вода, качество которой соответствует ВЭЖХ.
1) Лактоза
Моногидрат D-лактозы [(C12H22)O11. H2O] может впитывать повышенную влажность. Перед использованием необходимо измерить фактическое содержание воды по методу Карла Фишера или выпарить повышенную влажность, поместив лактозу на 8 часов в печь при температуре 105°C.
2) Концентрированный раствор Биггс/Сийярто
9,10 г дигидрата ацетата цинка [Zn(CH3COO)2.2H2O] и 5,46 г моногидрата фосфорно-вольфрамовой кислоты (H3[P(W3O10)4.xH2O]) растворяются в примерно 70 мл воды, качество которой соответствует ВЭЖХ, в мерной колбе емкостью 100 мл.
Добавляются 5,81 мл ледяной уксусной кислоты (CH3COOH). Затем раствор дополняется водой, качество которой соответствует ВЭЖХ, до отметки 100 мл и перемешивается. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 года.
3) Разбавленный раствор Биггс/Сийярто
25 мл концентрированного раствора Биггс/Сийярто разбавляются водой в мерной колбе до достижения отметки 500 мл. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца.
4) Приготовление воды, качество которой соответствует ВЭЖХ
Ультрачистая вода фильтруется через систему вакуумной фильтрации. Для улучшения мощности насоса и для получения стабильной базовой линии, подвижную фазу следует ежедневно дегазировать доступным методом, например, продувкой гелием, обработка ультразвуком, дегазирование в вакууме или в линии.
Для продления срока службы колонки, следует убедиться, что процент содержания углекислого газа в растворителе является максимально низким, и что исключено повторное поглощение.
4. Стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее:
1) Пластиковая колонка для ионного обмена ВЭЖХ
Наполнение колонки: 8% сополимер полистирола и дивинилбензола с поперечными связями с функциональными группами, способными к катионному обмену в форме свинца;
Размеры колонки: длина 300 мм, внутренний диаметр примерно, 8 мм.
Можно использовать и колонки другого диаметра, если поток был настроен соответствующим образом.
2) Колонка контроля
Колонка контроля представляет собой комбинацию между отдельным катионообменником (H+) и анионообменником, каждый встроенный в колонке примерно 30 мм х 4,6 мм (высота х внутренний диаметр). Колонки расположены рядами одна за другой или в форме смешанного слоя с AG 50W-X4, – 400 ячеек сети (H+) и AG3-X4A, 200-400 ячеек сети (OH-) в соотношении 35:65 (м/м), будучи вставлены вручную в одну большую колонку, примерно, 20 х 9 мм (длина х внутренний диаметр).
3) Печь колонки
Печь должна быть в состоянии поддерживать константную температуру 85 °C ± 1 °C.
4) ВЭЖХ насос
Насос должен быть в состоянии обеспечить константный расход (при колебаниях < 0,5 %) – 0,2-1,0 м/мин.
5) Система впрыскивания ВЭЖХ
Автоматический дискретизатор должен быть в состоянии впрыскивать объем, равный 25 мкл. Повторяемость должна составлять < 0,5 %.
В качестве альтернативного решения может использоваться ручная система.
6) Детектор ВЭЖХ
Необходимо использовать высокочувствительный детектор показателя преломления с шумовым уровнем < 5.10-9 RI.
7) Интегратор
Для регистрации данных, а также для генерирования площадей пиков или высот пиков, которые могут быть пересчитаны на концентрации лактозы, необходимо использовать программное обеспечение или интегратор.
8) Система очистки воды
Система должна быть в состоянии производить ультрачистую воду с удельным сопротивлением >14 MΩ.cm.
9) Система для фильтрования растворителя
Система должна быть в состоянии профильтровать воду через мембранный фильтр с размерами пор 0,45 мкм.
Многие системы очистки воды оборудованы встроенным 0,45 или 0,2 мкм фильтром. Можно отказаться от дополнительной фильтрации, если вода используется сразу же.
10) Аналитические весы
Весы с чувствительностью до 0,1 мг.
11) Водяная баня
В водяной бане должна поддерживаться константная температура 40 °C (±0,5).
12) Центрифуга
Центрифуга должна быть в состоянии ускорять трубки Eppendorf или аналогичные или большие по размерам типы трубок не менее 3000 г.
13) Мерная колба емкостью 50 мл
Емкость 50 мл, класс A.
При условии соблюдения коэффициента объема можно использовать и мерные колбы другой емкости.
14) Мерная колба емкостью 100 мл
Емкость 100 мл, класс A.
15) Мерная пипетка
Мерная пипетка емкостью 10 мл.
В качестве альтернативного решения может использоваться ручная вспомогательная пипетка емкостью 5 мл. В данном случае необходимо использовать два раза по 5 мл реактива (подпункт 3) пункта 4).
5. Важно, чтобы в лабораторию поступила проба, которая была отобрана в соответствии со стандартом SM SR EN 707, которая является действительно репрезентативной и не была повреждена во время транспортировки или хранения.
6. Эталонный раствор лактозы приготавливается следующим образом:
1) Эталонная проба 1
Примерно 50 мг моногидрата лактозы, взвешенные с точностью до 0,1 мг, растворяются в мерной колбе емкостью 100 мл. Затем колба заполняется водой до отметки максимального наполнения.
2) Эталонная проба 2
Примерно 100 мг моногидрата лактозы, взвешенные с точностью до 0,1 мг, растворяются в мерной колбе емкостью 100 мл. Затем колба заполняется водой до отметки максимального наполнения.
Эталонные растворы могут храниться при температуре примерно 5°C не более 1 недели.
7. Проба для анализа приготовляется следующим образом:
1) Восстановление пробы
Примерно 5 г сухого молока взвешиваются в колбе емкостью 50 мл. Масса определяется с точностью до 1 мг [W1, (11)]. После добавления 50 мл воды, увеличение массы [W2, (11)] определяется с точностью до 0,01 г. Закрытая колба помещается на 30 минут в водяную баню, переворачиваясь несколько раз в течение этого времени. Затем колбу следует охладить до комнатной температуры.
2) Обработка пробы
Отбирается примерно 1 г данного раствора и помещается в мерную колбу емкостью 50 мл. Определяется масса [W3 (11)] с точностью до 1 мг. После этого сначала добавляются 20 мл воды, а затем 10 мл разбавленного раствора Биггс/Сийярто. Колба дополняется водой до отметки максимального наполнения. Колба осторожно встряхивается 5 раз в течение первых 30 минут.
По истечении 1 часа отбирается одна аликвотная часть и центрифугируется 10 минут с 3000 г (при меньшем отрезке времени могут использоваться и большие ускорения). Одна аликвотная часть жидкой фракции используется для анализа ВЭЖХ.
8. Анализ ВЭЖХ осуществляется следующим образом:
1) Предварительное приготовление к ВЭЖХ
a) Установка основной колонки и предварительной колонки
Предварительная колонка (подпункт 2) пункта 5) устанавливается снаружи печи (подпункт 3) пункта 5), а основная колонка (подпункт 1) пункта 5) устанавливается в печи.
Если печь не оборудована трубками для предварительного нагрева растворителя, растворитель должен подаваться в печь через трубу из высококачественной стали длиной примерно 15 см, прежде чем он попадет в колонку, крайне важно, чтобы растворитель был нагрет до поступления в колонку, в противном случае, пики станут чрезмерно широкими.
b) Детектор и исходный расход
Для получения стабильной основной линии детектор ВЭЖХ следует включить не позднее, чем за 24 часа до начала анализа. Внутренняя температура детектора регулируется на 35°C. В течение не менее 20 минут устанавливается расход 0,2 мл/мин. (подпункт 4) пункта 5), в то время как температура печи регулируется согласно комнатной температуре.
c) Печь колонки и конечный расход
Печь колонки регулируется на 85 °C. После достижения данной температуры, в течение 30 минут расход постепенно повышается с 0,2 мл/мин до 0,6 мл/мин (подпункт 4) пункта 5). Следует подождать пока прибор придет в равновесие при данном расходе и при температуре 85 °C (2 часа или до достижения стабильной основной линии).
d) Интеграция
Необходимо тщательно выбирать параметры для регистрации и интеграции данных (подпункт 7) пункта 5), как, например, скорость передачи данных, чувствительность, временная константа, ширина пики и пороговая величина.
Время удерживания составляет для лактозы, примерно, 11 минут.
Многие программные обеспечения, используемые для регистрации данных (подпункт 7) пункта 5), делают возможным удобный теоретический чашечный подсчет. Теоретический чашечный подсчет эталонного раствора 1 проводится регулярно. Если результаты чашечного подсчета ниже исходной величины новой колонки на 25% и более, колонку следует заменить (подпункт 1) пункта 5).
e) Проверка предварительной колонки
Необходимо регулярно (т. е. не менее одного раза за каждый цикл анализа) проверять, в состоянии ли предварительная колонка отделять соли из пробы, для чего впрыскиваются 25 мкл 0,05% раствора натрия хлорид. Необходимо каждый раз заменять предварительную колонку, как только появляются пики.
2) Измерение эталонных проб
Каждый раз в начале цикла анализа впрыскиваются 25 мкл (подпункт 5) пункта 5) эталонной пробы 1, а затем эталонной пробы 2. Эти впрыскивания повторяются каждый раз после каждых 10-20 проб, а также по окончании цикла анализа.
3) Измерение проб
Впрыскиваются 25 мкл жидкой фракции (подпункт 2) пункта 8) пробы.
9. Расчет и представление результатов осуществляется следующим образом:
1) Калибровка
Как правило, результаты рассчитываются на основании площадей пиков. В том числе и при слишком сильном уровне шума могут использоваться площади результатов (в случае количественного определения при помощи высоты пиков существует незначительный риск неучета пиками компонентов в низкой концентрации, которые всего лишь частично, но не достаточно могут быть разграничены от пика лактозы).
При помощи программного обеспечения (подпункт 7) пункта 5) рассчитывается линейная калибровочная кривая, проходящая через исходный уровень. Необходимо проверять кривую на вопрос возможного отклонения линейности (видимые отклонения линейности объясняются чаще всего ошибкой при приготовлении эталонного раствора 1 или 2, или плохой интеграцией либо, что реже, неисправным инжектором).
В качестве исходных данных берутся концентрации лактозы, рассчитанные в мг/мл эталонного раствора 1 и 2, как безводные лактозы.
Подъем (RF) калибровочной линии зависит от соотношения между площадью и концентрацией в мг/мл.
2) Проба
Результат анализа выражается в г/ 100 г и рассчитывается при помощи программного обеспечения (подпункт 7) пункта 6) или по следующей формуле:
где:
C – концентрация лактозы в г/100 г сухого молока;
H – высота пика лактозы в пробе;
RF – калибровочный коэффициент (или подъем) калибровочной кривой в mV/мг/мл;
W1 – масса пробы сухого молока в г (подпункт 1) пункта 8);
W2 – масса воды, добавленной к пробе сухого порошка (подпункт 1) пункта 8);
W3 – масса реконструированного раствора сухого молока в г (подпункт 2) пункта 8);
50 – объем использованной мерной колбы (подпункт 2) пункта 8);
0,1 – перерасчет результата в г/100 г.
10. Возможно, что величины, полученные в результате данного межлабораторного теста, смогут быть применимы только для указанных здесь диапазонов концентрации и матриц. Величины для повторяемости и воспроизводимости опираются на результаты межлабораторного теста, проведенного согласно SM SR ISO 5725-1.
1) Повторяемость
Абсолютная разница между двумя отдельными результатами анализа, полученными по одному и тому же методу с использованием одинакового материала для анализа в одинаковых лабораториях одними и теми же аналитиками при использовании одинакового оборудования, не превышает более 5% случаев, ХХХ (что следует проверить совместными опытами).
2) Воспроизводимость
Абсолютная разница между двумя отдельными результатами анализа, полученными по одному и тому же методу с использованием одинакового материала для анализа в различных лабораториях различными аналитиками при использовании различного оборудования, не превышает более 5% случаев, 0,5 г/100 г (что следует проверить совместными опытами).
