Лабораторная работа №1
НУКЛЕОПРОТЕИДЫ
Нуклеопротеиды представляют собой сложные белки, состоящие из простого белка и небелковой части - нуклеиновых кислот. Из этих белков состоит основная масса клеточного ядра. Именно поэтому нуклеопротеиды могут быть легко выделены из тканей, богатых ядерным веществом (зобной железы, семенников, сперматозоидов и др.). Нуклеопротеиды играют важную биологическую роль. Они являются не только структурными элементами клетки, ее ядра и цитоплазмы, но и выполняют важнейшие специфические функции в живом организме. Деление клеток, биосинтез белков, передача наследственной информации тесно связаны с нуклеопротеидами, в частности с входящими в их состав нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновые кислоты являются высокомолекулярными соединениями, построенными из большого количества мононуклеотидов. Мононуклеотиды состоят из пуринового или пиримидинового основания, углеводного компонента (рибозы или дезоксирибозы) и фосфорной кислоты.
Пуриновые основания можно рассматривать как производные пурина. В состав нуклеиновых кислот входят два пуриновых основания - аденин и гуанин:
Пиримидиновые основания - цитозин, урацил, тимин - можно рассматривать как производные пиримидина:
Кроме того, открыт еще ряд минорных оснований: 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин в составе ДНК, диметилгуанин, метиладенин в составе РНК и др.
В качестве углеводного компонента в нуклеиновые кислоты входят рибоза и дезоксирибоза:
Примером мононуклеотида является адениловая кислота:
Мононуклеотиды носят разные названия в зависимости от входящего в их состав пуринового или пиримидинового основания, например, адениловая кислота (аденин), гуаниловая кислота (гуанин), цитидиловая кислота (цитозин) и др. Отдельные мононуклеотиды в молекуле нуклеиновой кислоты соединяются между собой посредством кислородных мостиков, образующихся за счет гидроксильной группы третьего углеродного атома пентозы одного мононуклеотида и гидроксила фосфорной кислоты соседнего нуклеотида.
В живых организмах обнаружены два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). Разница в химическом составе между ДНК и РНК состоит в том, что углеводным компонентом в ДНК является дезоксирибоза, а в РНК - рибоза; кроме того, в ДНК наряду с другими азотистыми основаниями входит тимин, а в РНК вместо тимина - урацил.
При проведении частичного гидролиза нуклеопротеиды распадаются на белки, преимущественно основного характера (протамины и гистоны), и нуклеиновые кислоты. При более полном гидролизе белки и нуклеиновые кислоты распадаются на свои основные компоненты, что можно представить в виде следующей схемы:
Работа 1. Гидролиз нуклеопротеидов дрожжей
Цель – изучить химический состав нуклеопротеидов дрожжей.
Для изучения химического состава нуклеопротеидов проводят гидролиз дрожжей, которые берут в качестве источника, богатого нуклеопротеидами, и открывают продукты гидролиза: полипептиды, пуриновые основания, углеводный компонент (рибозу и дезоксирибозу) и фосфорную кислоту.
Ход работы. 1. Проведение гидролиза. В большую широкогорлую пробирку (15х1,5 см) помещают 0,1 г сухих пекарских дрожжей, приливают 4 мл 10% раствора Н2SО4, закрывают пробкой, в которую вставлена в качестве холодильника трубка длиной 25- 30 см, взбалтывают и закрепляют так, как показано на рис. 1.
Гидролиз проводят при нагревании около часа, считая с момента закипания. После окончания гидролиза жидкость охлаждают и затем фильтруют через складчатый фильтр. С фильтратом проделывают следующие реакции.
2. Биуретовая реакций на полипептиды. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10% раствора NаОН и 1-2 капли 1 % раствора СuSO4 до появления сине-фиолетового или красно-фиолетового окрашивания, что свидетельствует о присутствии в пробе полипептидов как продуктов гидролиза белковой части нуклеопротеидов.
3. Проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного раствора аммиака для нейтрализации и 5 капель 1% раствора АgNО3. При стоянии выпадает рыхлый осадок бурого цвета, обусловленный образованием серебряных соединений пуриновых оснований.
Рис. 1. Прибор для гидролиза.
а - штатив; б - газовая горелка; б - асбестовая сетка; г - металлическое кольцо; д - пробирка для гидролиза; е - трубка-холодильник.
4. Качественные реакции на углевод (рибозу и дезоксирибозу).
Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы, имеющих свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать металлы (медь, висмут, железо) в щелочной среде. При этом металлы восстанавливаются из окисной формы в закисную или в случае закиси до свободного состояния; сахара же дают различные продукты окисления.
а) Проба Троммера заключается в восстановлении окисной меди в закисную под влиянием рибозы и дезоксирибозы, присутствующих в гидролизате дрожжей; реакция протекает в щелочной среде согласно следующим уравнениям:
CuSO4+2NaOH→Cu(OH)2+Na2SO4
Избыток CuSO4 мешает реакции, так как ведет к образованию большого количества Сu(ОН)2, который при нагревании распадается с образованием черного осадка окиси меди:
Cu(OH)2→CuO+H2O
Окись меди
(черного цвета)
К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30% раствора едкого натра и несколько капель 7% раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидроокиси меди Сu(ОН)2. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидрата закиси меди СuОН или красный осадок закиси меди Сu2О.
б) Проба Фелинга является модификацией пробы Троммера. В данной реакции употребляют жидкость Фелинга, в которой ион двухвалентной меди связан в виде комплексного соединения с виннокаменной солью.
Для получения реактива Фелинга в пробирке смешивают 5 капель 7% раствора сернокислой меди и 5 капель раствора сегнетовой соли. К полученному реактиву Фелинга добавляют 5-7 капель гидролизата, перемешивают и нагревают до начала кипения. Выпадает осадок гидрата закиси меди СuОН желтого цвета или осадок закиси меди Сu2О красного цвета.
5. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель молибденового реактива, представляющего собой раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте, и кипятят. При охлаждении пробирки под струей холодной водопроводной воды выпадает кристаллический осадок лимонно-желтого цвета, обусловленный образованием фосфорномолибденовокислого аммония.
12(NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21HNO3 →
→21NH4NO3 + (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O + 6H2O
Фосфорномолибденовокислый
аммоний (лимонно-желтого цвета)
Вопросы
1. Дать определение нуклеиновым кислотам
2. Назовите представителей пуриновых и примидиновых оснований
3. Чем отличается углеводный компонент ДНК и РНК?
4. На счет каких групп образуется связь между отдельными мононуклеотидами в молекуле нуклеиновых кислот?
5. Назовите отличия в строении ДНК и РНК
6. Какие продукты образуются в результате частичного гидролиза нуклеопротеидов?
7. На какие основные компоненты распадаются белки и нуклеиновые кислоты при полном гидролизе?
8. Какой реакцией определяют наличие в гидролизате полипептиды?
9. С помощью каких качественных реакций определяют углеводы, содержащиеся в гидролизате нуклеопротеидов? На чем они основаны?
10. Как определяют остатки фосфорной кислоты в гидролизате нуклеопротеидов?
11. Опишите методику выделения нуклеиновых кислот из биологического объекта на примере лука
12. Объясните цель использования того или иного приема при выделении нуклеиновых кислот.
