Реакции папаина с электрогенерированными галогенами и их аналитическое применение

Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно

действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/

УДК 543.25:543.8. Поступила в редакцию 19 декабря 2007 г.

Реакции папаина с электрогенерированными галогенами

и их аналитическое применение

Ó Зиятдинова Гузель Камилевна,+

и *

Кафедра аналитической химии. Химический институт им.

Казанского государственного университета. Ул. Кремлевская, 18. г. Казань, 420008.

Республика Татарстан, Россия. Тел.: [phone]. E-mail: [e-mail]

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: гальваностатическая кулонометрия, электрогенерированные галогены, папаин, цистеиновые протеиназы.

Аннотация

Найдены стехиометрические коэффициенты реакций папаина с электрогенерированными галогенами, которые составили 1:5 и 1:3 для хлора и брома, соответственно. Разработан способ определения папаина методом кулонометрического титрования электрогенерированными хлором и бромом. Обсуждено возможное участие серосодержащих центров молекулы фермента в реакциях с галогенами. Показана возможность определения микрограммовых количеств папина в модельных растворах с величиной относительного стандартного отклонения 0.03-0.08.

Введение

Папаин является одним из протеолитических ферментов – цистеиновых протеиназ, присутствующих в латексе дынного дерева (Carica papaya L.). Название "папаин" было впервые предложено в конце XIX века А. Вюрцем и Е. Бошутом и используется до настоящего времени для обозначения препаратов латекса.

Этот фермент содержится во всех частях растения за исключением корней. Неочищенный или частично очищенный папаин в прошлом был объектом многочисленных исследований. Однако, позднее было установлено, что сухой латекс дынного дерева, кроме папаина, содержит целый набор цистеиновых протеиназ, которые разделяются на три главные группы, собственно папаин, химопапаины А и В и пептидазы А и В. В последние годы папаин и химопапаины были обнаружены также в латексе из вегетативных органов (листьев и черешков) дынного дерева. В 1937 г. Болз и сотр. впервые получили кристаллический папаин, а в 1941 г. Янсен и Болз – кристаллический химопапаин [1].

Три главные группы ферментов латекса папайи различаются по физико-химическим свойствам. Так, они характеризуются разными значениями изоэлектрических точек, которые находятся в зоне рН 9.5, 10.1-10.6 и 11.1 для папаина, химопапаинов и пептидаз, соответственно. Различаются эти группы ферментов и по содержанию титруемых свободных SH-групп. Ферменты первой и третьей групп содержат 1 SH-группу на молекулу белка, ферменты второй группы – 2 [2].

Папаин является наиболее изученным ферментом, хотя на его долю приходится только около 5% общего содержания растворимого белка латекса дынного дерева. Молекулярная масса фермента, определенная Э. Смитом и др. на основании скорости седиментации и диффузии, равна 20.7 кДа. Молекула папаина состоит из одной полипептидной цепи и содержит 212 аминокислотных остатков. Характерной особенностью аминокислотного сос-тава фермента является отсутствие остатков метионина [3].

Папаин относительно устойчив в нейтральной и слабощелочной среде, но быстро и необратимо теряет активность в области кислых значений рН. По сравнению с другими протеиназами растительного происхождения (например бромелаином и фицином) папаин проявляет значительную устойчивость к действию повышенных температур. Фермент стаби-лен в лиофилизованном неактивированном состоянии. Потеря активности в водных растворах происходит медленно, но зависит от температуры хранения. При инкубации в присутствии активаторов папаин теряет активность в результате автолиза. Впервые процесс автолиза папаина наблюдали при ионнообменной хроматографии. Медленное протекание процесса автолиза является причиной того, что даже наиболее активные препараты фермента оказы-ваются загрязненными низкомолекулярными продуктами [4].

Молекула папаина обладает высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям. Так, оптическое вращение молекулы папаина существенно не меняется в 6-8 М растворе мочевины или в 70% метиловом спирте.

Кристаллический папаин обладает, как правило, низкой активностью в отсутствие активаторов. В роли активаторов могут выступать различные низкомолекулярные тиолы, цианиды и ряд других веществ, обладающих свойствами восстановителей, например цистеин, глутатион, тиогликолевая кислота, тиосульфат и боргидрид натрия.

Для получения максимальной активности папаина необходимо одновременное присутствие восстановителя и веществ, способных связывать ионы металлов. Например, используют смесь цистеина (0.005 М) с этилентетрауксусной кислотой (0.002 М) или с версеном (0.001 М). Эта смесь может быть успешно заменена 2,3-меркаптопропанолом, соединением, которое способно одновременно связывать металлы и действовать как восстановитель. Максимальная активность папаина в присутствии активаторов достигается через 5-10 мин [5].

Природа активаторов, а также отношение папаина к окислительным агентам и вещест-вам, специфически блокирующим сульфгидрильные группы белков, позволили давно сделать вывод, что папаин относится к классу цистеиновых протеиназ. Содержание тиоловых групп у неактивного папаина менее 0.5 моля на моль белка, и это же количество определяется при различных способах денатурации фермента. В то же время в активированном папаине присутствует до 1 моля SH-групп на моль белка. Более того, существует корреляция между содержанием тиоловых групп в молекуле папаина и его удельной активностью [6].

Исследования механизма процесса активации и природы неактивной формы папаина позволили И. Клейну и Дж. Киршу получить убедительные доказательства того, что основной компонент неактивного папаина представляет собой смешанный дисульфид белок – цистеин [7].

Папаин используется в пищевой и легкой промышленности для обработки кож, умяг-чения мяса и осветления напитков [8]. В последние десятилетия папаин нашел широкое применение в составе лекарственных и косметических средств как основной компонент, влияющий на активность ферментов кожи, регулируя ряд биохимических процессов в ней. Косметический эффект папаина заключается в том, что он удаляет отмершие клетки, выравнивает рельеф кожи и стимулирует обмен клеток эпидермиса. Поэтому исследование папаина и разработка способов его определения представляет актуальную задачу.

Цель работы – оценить возможности гальваностатической кулонометрии с электро-генерированными галогенами для количественного определения папаина.

Результаты и их обсуждение

Кулонометрическое титрование стандартных растворов электрогенерированными хлором и бромом папаина показало, что реакции этих титрантов протекает быстро и количественно. Результаты титрования позволили установить стехиометрические коэффици-енты реакций, которые составили 1:5, 1:3 для хлора и брома, соответственно. Иод не взаимодействует с папаином, вероятно, вследствие стерических препятствий и его малой реакционной способности в этом процессе.

Как уже отмечалось выше, папаин является серосодержащим ферментом класса протеиназ. В структуре папаина присутствуют семь остатков цистеина (Cys). Шесть из семи содержащихся в молекуле остатков Cys участвуют в образовании трех дисульфидных мости-ков, которые соединяют остатки полуцистина в положениях 22-63, 56-93 и 153-200 (заштри-хованные связи на рисунке). Единственная сульфгидрильная группа принадлежит остатку цистеина, расположенному в положении 25. Этот остаток является частью каталитического центра фермента [24].

Молекула фермента имеет близкую к сферической форму и состоит из двух доменов, обозначенных как L- и R-домены. Домены разделены глубоким "желобом", на поверхности которого находится активный центр фермента. Оба домена содержат практически одинаковое число аминокислотных остатков. Положение одного домена относительно другого поддер-живается с помощью трех отрезков полипептидных "хребтов", пересекающих основание "желоба", и множеством водородных связей, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями боковых групп аминокислотных остатков полипептидной цепи. Централь-ная область R-домена представляет собой гидрофобное ядро [26, 27].

Рисунок. Домены в структуре протеолитического фермента папайи – папаина.
Прерывистыми линиями намечено направление впадины между двумя доменами, в которой связывается субстрат и размещен каталитический центр. Дисульфидные связи заштрихованы.

Таблица. Результаты кулонометрического определения

папаина в модельных растворах (n = 5, Р = 0.95)

Титрант	Введено, мкг	Найдено, мкг	Sr
Cl2	2.2	2.2±0.2	0.08
2.6	2.6±0.1	0.03
3.3	3.2±0.2	0.05
4.4	4.4±0.2	0.04
5.5	5.5±0.2	0.03
Br2	2.2	2.2±0.1	0.04
3.3	3.2±0.1	0.03
4.4	4.2±0.2	0.03
5.5	5.4±0.2	0.03
6.6	6.5±0.3	0.03

Исходя из результатов кулонометрического титрования, можно предположить, что в реакцию с электрогенерированными хлором и бромом вступает тиольная группа каталити-ческого центра фермента, расположенного на поверхности "желоба" между двумя доменами. Она окисляется до сульфоновой группы с участием 6 электронов. Электрогенерированный хлор взаимодействует и с дисульфидным фрагментом в положении 22-63. При этом происходит окисление дисульфида до сульфоксида, а электрогенерированный бром не реагирует вследствие стерических затруднений. Два других дисульфидных мостика не вступают в реакцию с электрогенерированными галогенами, поскольку один находится в гидрофобной области молекулы папаина (R-домена), а второй – на значительном расстоянии от активного центра в перпендикулярной плоскости.

Результаты кулонометрического определения папаина в модельных растворах предс-тавлены в таблице.

Экспериментальная часть

Электрогенерацию галогенов осуществляли на потенциостате П-5827М при постоянной силе тока 5.0 мА из водных 0.2 М KBr в 0.1 М Н2SO4 и из 0.1 М раствора KI в тартратном буферном растворе с рН 3.56. Конечную точку титрования устанавливали амперометрически с двумя поля-ризованными платиновыми электродами (DЕ=300 мВ). Рабочим электродом служила гладкая плати-новая пластинка площадью 1 см2, вспомогательным электродом – платиновая спираль, отделенная полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.

Кулонометрическое определение проводили следующим образом. В ячейку объемом 50.0 мл вводили 20.0 мл фонового раствора, опускали электроды и включали генераторную цепь. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносили аликвоту исследуемого раствора (10-60 мкл) и одновременно включали секундомер. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного тока. При этом выключали секундомер и отключали генераторную цепь.

В работе использовали лиофилизированный папаин от Ferak (Berlin, Germany). Стандартные растворы готовили по точной навеске (около 1.0 г), которую растворяли в 50 мл дистиллированной воды.

Выводы

Найдены стехиометрические коэффициенты реакций папаина с электрогенерирован-ными галогенами, которые составили 1:5 и 1:3 для хлора и брома, соответственно. Электро-генерированный иод не взаимодействует с папаином в условиях гальваностатической кулонометрии. На основе полученных данных обсуждено участие серосодержащих центров молекулы фермента в реакциях с галогенами и разработан способ определения папаина.

Литература

[1] Blocklehurst K., Baines B. S., Kierstan M. P.J. Papain and other constituents of Cartica papaya L. In: Topics on enzyme and fermentation biotechnology ( E. Wiseman, E. Horwood). Chichester: Ellis Horwood Ltd. 1981. Vol.5. P.262-335.

[2] Мосолов ферменты. М.: Наука. 1971. 414с.

[3] Glazer A. N., Smith E. L. Papain and other plant sulfhydryl proteolytic enzymes. In: The enzymes. Academic press. 1971. Vol.3. P.501-546.

[4] Drenth J. Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas. 1980. Vol.99. No.6. P.185-190.

[5] Polgar L., Csoma C. Characterization of active site of cysteine proteases. In: Molecular and cellular regulation of enzyme activity ( A. Barth, R. L. Schwen, H. Possin). Berlin:Verlag. 1986. P.1-10.

[6] Beker E. N., Drenth J. The thiol proteases: structure and mechanism. In: Biological macromolecules and assemblies ( F. A. Iurnak, A. McPherson). N. Y.: J. Wiley&Sons. 1987. Vol.3. P.314-368.

[7] Klein I. B., J. F. Kirsch. Biochem. Biophys. muns. 1969. Vol.34. No.5. P.575-581.

[8] Кретович биохимии растений. 5 изд. М. 1971. 460с.