Физиология растений (стр. 1 )

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет»

Биолого-почвенный факультет

ФИЗИОЛОГИя РАСТЕНИЙ

методические указания

Рецензенты:

канд. биол. наук, доц. кафедры ботаники и генетики

,

д-р биол. наук, гл. науч. сотр. лаборатории физиологической

генетики СИФИБР СО РАН

Составители:

канд. биол. наук, доц. ,

канд. биол. наук, доц. ,

канд. биол. наук, доц. ,

ассист.

(кафедра физиологии растений и клеточной биологии)

Методические указания предназначены для студентов 3-го курса специальностей «Биология», «Физиология» и «Микробиология» очного обучения и студентов 4-го курса специальности «Микробиология» очно-заочного обучения и включают лабораторные работы, задачи, контрольные вопросы и итоговые тесты по трем основным темам: «Фотосинтез», «Дыхание» и «Минеральное питание» курса «Физиология растений», входящего в цикл общепрофессиональных дисциплин учебного плана по вышеперечисленным специальностям.

ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтез – наиболее мощный процесс преобразования солнечной энергии в свободную энергию органических соединений. Для осуществления этого уникального процесса в ходе эволюции был создан фотосинтетический аппарат, содержащий: 1) набор фотоактивных пигментов, способных поглощать определенные области электромагнитного излучения и запасать эту энергию в виде энергии электронного возбуждения; 2) специальный аппарат преобразования энергии электронного возбуждения в разные формы химической энергии (АТФ, НАДФН2), которая затем преобразуется в свободную энергию органических молекул.

Основные термины и понятия,
необходимые для изучения

Хлоропласты, тилакоиды, граны, строма, ламеллы. Фотосинтетические пигменты: хлорофиллы, каротиноиды, фикобилины; сопряженная система связей, П-электроны, вакантные орбитали, способы дезактивации возбужденного состояния хлорофилла. Хроматическая адаптация. Светособирающие комплексы, реакционные центры, элентрон-транспортные цепи, АТФ-синтазный комплекс, водорасщепляющий комплекс. Фотофизический, фотохимический и энзиматический этапы световой фазы. Фотосистемы: принцип работы, характеристика переносчиков, причины создания протонного градиента. Виды фотофосфорилирования: циклический, нециклический, псевдоциклический.

Темновая фаза фотосинтеза: метод меченых атомов, фиксация углекислого газа, разнообразие путей восстановления СО2: цикл Кальвина, цикл Хэтча – Слэка, САМ-метаболизм, фотодыхание (линейное и циклическое), причины и условия фотодыхания, преимущество растений С4-типа перед растениями С3-типа.

Работа 1

ПИГМЕНТЫ ЗЕЛЕНОГО ЛИСТА

Фотосинтез, т. е. образование органических веществ из углекислоты и воды с использованием световой энергии, происходит в зеленых пластидах – хлоропластах. В состав хлоропластов высших растений входят следующие пигменты:

хлорофилл «а»: C55H72O5N4Mg – зеленый с синеватым оттенком,

хлорофилл «б»: C55H70O6N4Mg – зеленый с желтоватым оттенком,

каротин: C40H56 – желто-оранжевый,

ксантофилл: C40H56O2 – золотисто-желтый.

Все эти пигменты нерастворимы в воде, но растворимы в органических растворителях (спирте, ацетоне и др.). Задача данной работы – получение спиртовой вытяжки из зеленых листьев и ознакомление с некоторыми физико-химическими свойствами пигментов.

Извлечение пигментов

Листья любого комнатного растения нарезать в фарфоровую ступку и растереть с небольшим количеством этилового спирта, прибавив на кончике скальпеля СаСО3 (для нейтрализации кислот клеточного сока). Носик ступки с наружной стороны смазать вазелином. После небольшого отстаивания зеленый раствор осторожно по палочке слить в воронку с сухим фильтром. Оставшуюся в ступке густую массу снова растереть со спиртом. После отстаивания жидкость перенести на фильтр. Эту операцию повторить несколько раз, пока раствор не станет бесцветным. С полученной вытяжкой провести ряд опытов.

Опыт 1. Флуоресценция хлорофилла

Флуоресценция – это явление свечения веществ при поглощении ими света. При этом в большинстве случаев излучаемый свет имеет длину волны большую, чем поглощаемый. Флуоресценция – это признак фотохимической активности вещества.

Вытяжку пигментов поместить на черном фоне у электролампы (лучше синего цвета), рассмотреть окраску вытяжки в отраженном свете. Вишнево-красный цвет вытяжки в отраженном свете свидетельствует о способности хлорофилла флуоресцировать. Объяснить, почему зеленый лист не флуоресцирует, а экстрагированный хлорофилл флуоресцирует.

Опыт 2. Разделение пигментов по Краусу

Этот метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине.

В пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки, прибавить примерно полуторный объем бензина и несколько капель воды для того, чтобы спирт не смешивался с бензином. Пробирку накрыть и несколько раз сильно встряхнуть, а затем дать 2–3 мин постоять. При этом происходит разделение слоев: верхний зеленый слой (бензиновый) содержит оба зеленых пигмента и каротин, а нижний желтый слой (спиртовой) содержит ксантофилл.

Опыт 3. Омыление хлорофилла и отделение каротина

В пробирку с 2–3 мл вытяжки прибавить несколько капель 20 % спиртового раствора щелочи. Налить 1–1,5 мл бензина и 2 капли дистиллированной воды. Сильно встряхнуть, а затем дать отстояться.

Нижний спиртовой слой содержит соль хлорофилловой кислоты (продукт омыления хлорофилла) и ксантофилл. Верхний бензиновый слой – каротин.

Можно произвести омыление и после разделения слоев по Краусу. Прибавляя в ту же пробирку кусочек едкого калия, встряхнуть и наблюдать обратное размещение слоев.

Уравнение реакции хлорофилла со щелочью:

СООСН3 СООNa

 

MgN4OН30С32 + 2NaOH = MgN4H30OC32 + C20H39OH + CH3OH

 

COOC20H39 COONa

Объяснить, почему происходит изменение окраски слоев.

Опыт 4. Получение феофитина и восстановление металлорганической связи

В пробирку налить 2–3 мл спиртовой вытяжки и добавить 1–2 капли 10 % HСl. При взбалтывании вытяжка становится бурой вследствие образования производного хлорофилла – феофитина (в хлорофилле атом магния замещается водородом). Реакция идет по следующему уравнению:

СООСН3 СООCH

 

MgN4OН30C32 + 2HCl = N4OH32C32 + MgCl2

 

COOC20H39 COOC20H39

К побуревшей вытяжке прибавить несколько кристалликов уксуснокислого цинка или меди, осторожно нагреть и наблюдать появление зеленой окраски благодаря восстановлению металлорганической связи.

Какие биологические функции выполняет феофитин?

Работа 2

РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЕТОДОМ
БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Метод основан на распределении пигментов между целлюлозой хроматографической бумаги и подвижной фазой – растворителями. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движутся растворители, молекулы пигментов, нанесенные на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с коэффициентом распределения. Чем выше растворимость пигмента, тем дальше он продвигается по бумаге вместе с растворителем и, наоборот.

Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения.

Ход работы. Взять навеску листьев 0,5 г. Мелко нарезать в ступку, добавить щепотку обезвоженного сернокислого натрия, несколько капель смеси ацетон-спирт (в соотношении 3:1), все тщательно растереть до однородной массы.

Добавить еще этой же смеси и отфильтровать. Ступку и растертую массу несколько раз ополоснуть этой же смесью, до тех пор, пока масса не обесцветится. Общий объем фильтрата измерить и записать.

Приготовить хроматографическую бумагу размером 15х20 см, и, отступив от краев по 2 см, провести простым карандашом линию. Приколоть бумагу кнопками к штативу для хроматограммы и по проведенной линии нанести пипеткой 2 мл фильтрата, но не сразу, а в несколько приемов.

В хроматографический цилиндр налить 15 мл смеси: петролейный эфир-бензин-ацетон (425 мл петролейного эфира – 25 мл бензина – 50 мл ацетона). Хроматограмму свернуть трубочкой и опустить в цилиндр; сторона, на которую нанесен фильтрат, должна быть внизу. Цилиндр закрыть крышкой и поставить на разгонку. Когда фронт растворителя дойдет до верхней границы (на 2 см ниже края бумаги), хроматограмму вынуть, высушить феном. В результате того, что пигменты различно адсорбируются хроматографической бумагой, они располагаются в следующей последовательности: хлорофилл «б», над ним хлорофилл «а», затем ксантофиллы, а выше каротины, поднимающиеся с фронтом растворителя (рис. 1).