Работа 2. Подсчет плотности суспензии.
Объяснение. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14-16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3 недели культивирования возрастает в 20 раз. Клетки суспензий удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах Фукса-Розенталя /гемоцитомерах/. Для подсчета клеток суспензии иногда используют временные препараты, но это более трудоемкий процесс: значительно увеличивается число повторностей.
Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема 8 % оксида хрома и нагревают до 700С в течение 2-15 минут. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу – 0,25 % объема.
Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии.
Материалы и оборудование. Микроскоп, центрифуга, колба с суспензией, стерильная пипетка, предметное стекло, покровное стекло, камера для подсчета элементов крови, фильтровальная бумага.
Ход работы.
1. Колбу с суспензией встряхнуть и отобрать пипеткой несколько мл суспензии.
2. 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8 % оксида хрома и поставить на 15 минут в термостат при температуре 700 С.
3. Смесь пропустить 3 раза через шприц с толстой иглой (пипетировать).
4. Камеру Фукса-Розенталя заполнить суспензией.
5. Подсчитать клетки под микроскопом.
6. Плотность суспензии рассчитать по формуле:
М´n´1000
Х= , где Х – число клеток в мл,
3,2 М – среднее число клеток в камере,
n – разведение.
