ЯМР 31Р спектроскопические исследования комплексобразования рутина с фосфатидилхолином

Публикация доступна для обсуждения в интернет как материал “Всероссийской рабочей

химической конференции “Бутлеровское наследие-2011”. http:///bh-2011/

Поступила в редакцию 28 марта 2011 г. УДК 539.1.07:577.127.4.33:547.972.35.

ЯМР 31Р спектроскопические исследования

комплексобразования рутина с фосфатидилхолином

© , ,

,

и *+

Кафедра медицинской физики. Башкирский государственный медицинский университет.

Ул. Ленина, 3. г. Уфа, 450000. Башкирия. Россия. Тел.: [phone]. E-mail: [e-mail]

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: рутин, фосфатидилхолин, ЯМР 31Р спектроскопия.

Аннотация

ЯМР 31Р спектроскопией исследованы химические сдвиги (ХС) ядер фосфора при формировании комплексов рутина с мембранным лецитином. Методами квантовой химии АМ1 и DFT проведены расчеты возможных моделей взаимодействующих молекул. Показано, что при образовании комплексов происходят изменения в электронной структуре фосфора.

Введение

Энергетические процессы, происходящие в биологических системах, как правило, связаны с атомами фосфора, и сопровождаются изменением электронного строения, струк-тура которых чувствительна к внешним воздействиям. Исследование ЯМР 31Р спектро-скопией электронного окружения позволяет получить новую информацию о процессах происходящих в липидных мембранах клеток. [1]

Липиды играют ключевую роль в структурной организации клеточных мембран. Мембранные липиды и белки контролируют транспорт ионов, процессы энергетики и другие функции клеток. Получение информации о механизме взаимодействия белка и лецитина с биологическими активными веществами раскрывает многие функции мембран.

Флавоноиды относятся к биологически активным соединениям полифенольной приро-ды, растительного происхождения, обладают широким спектром активностей, это противо-вирусное, антиаллергическое, антиоксидантное, Р-витаминное и другие [2-3]. 5,7,3',4'-Тетра-оксифлавон-3-рутинозид (рутин) является одним из представителей этого класса.

Фосфатидилхолин является структурообразующей частью мембранных липидов, содержит один атом фосфора, входит в состав фосфатной группы, которая является наиболее активным фрагментом молекулы [4]. Минимальное число атомов фосфора в молекуле упрощает ЯМР 31Р спектроскопические исследования. Они становятся более доступными для недостаточно оснащенных лабораторий, так как ограничения связанные с разрешением в отличие от спектроскопии ЯМР 1Н становятся не существенными, поэтому и интерпретация 31Р-ЯМР спектров упрощается.

Наличие значительной величины отрицательного заряда на фосфатной группе позволяет получать информацию о различных взаимодействиях с окружением этой группы. Что дает возможность изучать ЯМР спектроскопией взаимодействия с соседними атомами и фраг-ментами молекул.

Экспериментальная часть

В экспериментах использовался фосфатидилхолин, выделенный из куриных яиц, методом колоночной хроматографии производилась его очистка [5]. Чистота контролировалась по ЯМР спектрам и методами тонкослойной хроматографии. Образец 5,7,3',4'-тетраоксифлавон-3-рутинозид, получен от фирмы «Сигма-Алдрич».

В качестве растворителя использовался хлороформ и четыреххлористый углерод с индексом х. ч. без дополнительной очистки.

ЯМР спектры биологических систем от фосфора были зарегистрированы на модернизированном спектрометре BS 567А фирмы «TESLA» с частотой на ядрах 31Р 40.4 МГц.

Число накоплений составляло 400, при таком усреднении, отношение сигнала к шуму было не менее 15 [6]. Дальнейшая обработка спектра проводилась по программе, оптимизирующей центр резонансной линии, что давало достаточно стабильные результаты по определению химических сдвигов (ХС) с точностью не хуже 0.01 м. д. [7].

Стабилизация магнитного поля осуществлялась с помощью внешнего стандарта на ядрах 1Н, ХС на объемную восприимчивость стандарта не учитывался, все спектры были зарегистрированы с одним и тем же капилляром заполненным ГМДС. Спектры регистрировались при температуре 25 оС, ХС измерялись относительно 85% ортофосфорной кислоты, ХС которой был принят за ноль.

Добавление рутина в хлороформ с лецитином 0.0125 М/л концентрацией, приводит к изменению ХС относительно первоначального, на 0.54 м. д. в сторону сильного поля. В образцах, концентрацией 0.0125 М/л лецитина в четыреххлористом углероде, добавление рутина, изменяет ХС от ядер 31Р на 0.11 м. д. в сторону слабого поля.

Результаты и их обсуждение

Химический сдвиг ядра 31Р фосфатной группы зависит в основном от взаимодействий, в которых участвуют кислородные атомы, этой группы и составляет около 2 м. д. [8].

Эти взаимодействия могут быть электростатическими, водородными, дисперсионными, π-взаимодействиями, а также их комбинацией.

Табл. 1. Электронное строение и заряд в а. е. в приближение метода АМ1, атома фосфора
Атом	Тип орбитали и заряд (q)	Фосфатидилхолин
свободный	связанный
Р	S Px Py Pz	1.331 0.739 0.797 0.787	1.323 0.734 0.826 0.757
Σ	3.654	3.640
q	1.347	1.361

Результаты квантово-химических расчетов электронного строения рутина с фосфати-дилхолином табл. 1, а также ХС ядер 31Р позволяют предположить, что наиболее вероятными являются комплексы с системой π-электронов цикла С с одновременным формированием водородной связи протонов глюкозы рутина и кислородом гидрофильной части молекулы лецитина. Результаты полученные методом АМ1 качественно согласуются с результатами метода DFT. При таком взаимодействии происходит перераспределение заряда на фосфоре, фосфатной группы лецитина на 0.014 а. е., что приводит к уменьшению электронной плотности на ядре и к изменению ХС в сторону сильного поля.

При разбавлении фосфатидилхолина в четыреххлористом углероде, число водородных связей между кислородами фосфатной группы и какими либо водородами другой молекулы фосфатидилхолина, уменьшается. Поэтому среднее значение константы экранирования ядра 31Р также будет изменяться.

При образовании водородной связи протон, притягиваясь к электроотрицательному атому кислорода, будет уменьшать электронную плотность на нем, уменьшая тем самым электронную плотность на ядре фосфора. Сигнал от ядер 31Р лецитина, наблюдается в более слабом поле.

При разбавлении происходит умень-шение числа водородных связей, возрас-тает экранирование ядра 31Р, поэтому сиг-нал от фосфора смещается в более сильное поле.

При разбавлении фосфатидилхолина в хлороформе, наблюдается сдвиг 31Р ЯМР линии в сильное поле, и при концент-рациях меньших 0.025 М/л достигается плато. Очевидно, при этих концентрациях устанав-ливается динамическое равновесие, между числом рекомбинирующих и ассоциированных исходных молекул. При добавлении рутина, происходит взаимодействие его гидроксильных и рамнозо-глюкозных протонов с кислородами фосфатной группы по типу водородной связи. Одновременно происходит взаимодействие за счет π-систем циклов рутина с холиновой и фосфатной группами лецитина [9]. В результате таких взаимодействий образуется большое количество комплексов, которые имеют различные времена жизни. При малых временах жизни, по сравнению с временной шкалой ЯМР, они будут давать спектраль-ные линии, соответствующие усредненным сдвигам для крайних состояний [10].

Взаимодействием π-систем сопряженных колец рутина с фосфатной группой лецитина не позволяет «отсасывать» электронную плотность с атомов кислорода, а тем самым и с атомов фосфора, блокируя доступ, протонов рутина и хлороформа к фосфорным кислородам.

Заключение

Таким образом, спектры ЯМР на ядрах 31Р, и результаты квантово-химических расчетов изменений зарядов табл. 1, возникающих при взаимодействии рутина с лецитином, позволяют сделать вывод, что наиболее вероятными являются комплексы с участием π-системы электронов сопряженных колец рутина с фосфатной и холиновой группами, с одновременным взаимодействием по типу водородной связи протонов глюкозы рутина [11, 12].

Исследования показывают, что при формировании комплексов рутин – фосфатидил-холин, электронная плотность, как у ядра фосфора, так и у кислородных атомов фосфатной группы меняется. Данные изменения электронной плотности связаны с типом взаимодейст-вия, возникающим между атомами фосфатной группы и фрагментами молекул рутина.

Литература

[1]  , , Пономарева комплексов молекулы пиразола с фосфолипидами. Биофизика. 1991. Т.36. №4. С.594-598.

[2]  Bartlett G. R. Inhibition of succinoxidase by the vitamin P-like flavonoid 2′,3,4-trihydrohychalcone. J. Pharmacol. Exp. Therap. 1948. Vol.93. Р.329-337.

[3]  Imperato F. Two new flavonol glycosides from the fern Pteridium aquilinum. 2 nd International Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry. September 1-30. 1998. dp074.

[4]  , Берестовский бислой биологических мембран. М.: Наука. 1982. С.224.

[5]  R. M.C. Dawson. Biochеm. 1993. Vol.88. No.3. P.414-423.

[6]  Koler S. J., Klein M. P. 31P nuclear magnetic resonance chemical shielding tensors of phosphorylethanolamine, lecithin and related compounds: A pplications to head-group motion in model membranes. Biochemistry. 1976. Vol.15. Nо.5. Р.967-976.

[7]  , , О модернизации спектрометра TESLA BS-567A. Датчики и системы. 2006. №2. С.38-39.

[8]  Berden J. A., Barker R. W., Radda G. K. NMR studies on phospholipids bilayers: Some factors affecting lipid distribution. BBA. 1975. Vol.375. Nо.2. Р.186-208.

[9]  , , О молекулярном механизме биоактивности рутина. Химическая физика и мезоскопия. 2008. Т.10. №2. С.228-231.

[10]  , Федин магнитный резонанс. Новосибирск: Наука. 1980.

[11]  , , Насибуллин рутина с фосфатидилхолином. Бутлеровские сообщения. 2006. Т.9. №4. С.21-25.

[12]  , , Насибуллин некоторых биологически активных молекул с фосфатидилхолином. Известия вузов. Физика. 2009. Т.52. №4. С.77-81.