Приложение
к Методологии анализа и качественной
оценки молока и молочных продуктов
Определение содержания триглицеридов энантовой кислоты в сливочном масле, топленом масле и сливках путем хроматографического анализа в газовой фазе триглицеридов
1. Настоящий метод устанавливает метод для определения содержания триглицеридов энантовой кислоты в сливочном масле, топленом масле и сливках.
2. Содержание энантовой кислоты представляет содержание триглицеридов энантовой кислоты, определяемое с использованием процедуры, указанной в настоящем приложении.
Содержание энантовой кислоты выражается в кг/тонн продукта для топленого масла и сливочного масла, а для сливок – в кг/тонн молочного жира.
3. Молочный жир экстрагируется из различных продуктов в соответствии с SM ISO 14156. Количественное определение содержания триглицеридов энантовой кислоты в экстрагированном жире осуществляется с использованием хроматографического анализа в газовой фазе в капиллярной колонке (GC). Полученный результат пробы оценивается с применением стандарта, относящегося к триглицеридам капроновой кислоты.
4. Используются признанные реактивы аналитического качества:
1) н-гексан;
2) триглицериды эталоннной капроновой кислоты, чистота не менее 99%;
3) триглицериды эталонной энантовой кислоты, чистота не менее 99%;
4) сульфат натрия, безводный (Na2SO4).
5. Стандартное лабораторное оборудование:
1) аналитические весы с точностью до 1 мг;
2) мерные колбы емкостью 10 мл и 20 мл;
3) центробежные трубки емкостью 30 мл;
4) ротационный испаритель;
5) печь, позволяющая поддерживать температуру 50 °C ± 5 °C;
6) фильтровальная бумага средней пористости диаметром примерно 15 см;
7) аппаратура для газовой хроматографии:
a) газовый хроматограф, оборудованный форсункой с или без разделения или «колонкой» и детектором ионизации пламени;
b) хроматографическая колонка для газовой хроматографии со стационарной фазой, которая успешно использовалась в операции по отделению триглицеридов (100 % диметилполисилоксан или 5 % фенил-95 % метилполисилоксан). Выбирается стационарная фаза, регулируется длина колонки (между 4 м и 15 м), внутренний диаметр (между 0,22 мм и 0,50 мм) и толщина слоя (0,12 μm или больше), с учетом опыта лаборатории и используемой системы инжекции. В любом случае, выбранная колонка производит одновременно полное разделение между вершиной растворителя и триглицеридами капроновой кислоты, а также разрешение основной линии между пиками триглицеридов капроновой кислоты и триглицеридами энантовой кислоты;
8) шприц для впрыскивания емкостью 5 μl.
6. Проба, принимаемая в лаборатории, должна быть репрезентативной, она не должна быть повреждена или изменена во время транспортировки или в период хранения.
Рекомендуемый метод по отбору проб представлен в SM SR EN ISO 707:2012 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб.
7. Приготовление пробы для анализа и анализируемого количества осуществляется в соответствии с SM ISO 14156:
1) топленое масло, сливочное масло;
a) растапливается от 50 г до 100 г пробы для анализа в печи.
b) добавляется от 0,5 г и 1 г безводного сульфата натрия в сложенную фильтровальную бумагу;
c) жир фильтруется через фильтровальную бумагу, содержащую безводный сульфат натрия. Фильтрат собирается в лабораторный стакан, который хранится в печи. Во время отстаивания большое внимание уделяется растопленному маслу в фильтровальной бумаге, во избежание переноса сыворотки.
2) Сливки:
a) анализируемая проба доводится до температуры 20 °C ± 2 °C;
b) проба перемешивается или хорошо встряхивается;
c) адекватное количество анализируемой пробы разводится массовой долей 4% жира до получения 100 мл анализируемого количества;
d) выполняются те же действия, как и в случае сырого и гомогенизированного молока (SM ISO 14156) для экстракции жира из сливок;
e) взвешивается с точностью до 1 мг 1 г экстрагированного жира в мерном стакане емкостью 10 мл. Добавляется 1 мл раствора, указанного в подпункте 1) пункта 8. Добавляется н-гексан до получения общего количества в 10 мл, и все перемешивается до получения однородной смеси;
f) добавляется 1 мл раствора, указанного в литере b) подпункта 1 настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл и растворяется н-гексаном до получения количества в 10 мл.
8. Приготовление калибровочных эталонов осуществляется следующим образом:
1) 100 мг триглицеридов энантовой кислоты разводятся в 10 мл гексана-н;
2) 100 мг триглицеридов капроновой кислоты разводятся в 10 мл гексана-н;
3) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 2) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл;
4) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 1) настоящего пункта, и 1 мл раствора, указанного в подпункте 2) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл;
5) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 4) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл.
9. Хроматографическое определение осуществляется следующим образом:
1) впрыскивается два раза по 1 мкл эталонного раствора, указанного в подпункте 5) пункта 8;
2) впрыскивается по 1 мкл из каждого пробного раствора.
В случае использования системы впрыскивания в колонке, как эталонный раствор, так и раствор пробы следует разбавить сильнее.
3) процедура, указанная в подпункте 1) настоящего пункта, повторяется для каждой третьей пробы для того, чтобы вначале и в конце серии проб можно было выполнить впрыскивание эталонного раствора. Результаты опираются на среднее арифметическое калибровочных коэффициентов эталонных хроматограмм.
10. По каждой хроматограмме интегрируются площади пиков триглицеридов энантовой и капроновой кислоты.
Данные инструкции повторяются для всех серий проб, в начале и в конце которых впрыскивается эталонный раствор. Непосредственно перед каждой серией проб впрыскивается два раза эталонный раствор STD1, и непосредственно после каждой серии проб впрыскивается два раза эталонный раствор STD2.
1) Калибровка:
a) для второй пробы STD1, Rf1(a) и Rf1(b) вычисляется коэффициент реактивности, где:
Rf1 (a) или (b) = (площадь пика триглицеридов капроновой кислоты/ площадь пика триглицеридов энантовой кислоты) × 100.
Рассчитывается средний коэффициент реактивности Rf1, где:
Rf1 = [Rf1(a) + Rf1(b)]/2;
b) Аналогично рассчитывается средний коэффициент реактивности STD2, Rf2.
c) Рассчитывается средний коэффициент реактивности Rf:
Rf = (Rf1 + Rf2)/2.
2) Анализируемые пробы
Для каждой полученной хроматограммы пробы между STD1 и STD2, рассчитывается содержание энантовой кислоты C (кг/тонн):
C = (площадь пика триглицеридов энантовой кислоты × Rf × 100)/(площадь пика триглицеридов капроновой кислоты × Wt × 1 000), где:
Wt = масса отобранного жира (g);
100 = разводимый объем для пробы;
1 000 = переводный коэффициент (для μg/г на кг/т).
Для проб сливочного масла учитывается содержание жира в сливочном масле и рассчитывается чистое значение степени концентрации Cсливочное масло (кг/т сливочного масла):
Cсливочное масло = Cжир × F,
где F - содержание жира в сливочном масле.
11. Предельные значения повторяемости и воспроизводимости выражаются для доверительного интервала в 95 %, при этом возможно, что они не смогут быть применимы для других интервалов концентрации и матриц, чем показанные.
1) Повторяемость
Абсолютные разницы между двумя отдельными результатами теста, полученными один и тем же методом, с использованием идентичного материала для проведения теста, в той же лаборатории и тем же аналитиком, с использованием одного и того же оборудования, в течение короткого периода времени, составляют не более 0,35 кг/т в не более чем 5% всех случаев.
2) Воспроизводимость
Абсолютные разницы между двумя отдельными результатами теста, полученными один и тем же методом, с использованием идентичного материала для проведения теста, в разных лабораториях разными аналитиками, с использованием различного оборудования, составляют не более 0,66 кг/т в не более чем 5% всех случаев.
12. Пределы допуска: нижний предел (в случае недостаточного количества):
1) для проверки правильной маркировки продукта необходимо отобрать три пробы исследуемого продукта;
2) сливочное масло и масляный жир:
a) доля примесей составляет 11 кг триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты в 95% на тонну сливочного масла, т. е. 10,45 кг/т;
b) результаты трех проб, полученных вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных величин:
- 9,51 кг/т (95% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);
- 6,89 кг/т (70% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);
- используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, полученным путем интерполяции между 9,51 кг/т и 6,89 кг/т.
3) Сливки:
a) примесь составляет 10 кг триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95% на тонну молочного жира, соответственно 9,5 кг/т промаркированного молочного жира;
b) результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных величин:
- 8,60 кг/т (95% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);
- 6,23 кг/т (70% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);
- используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, полученным путем интерполяции между 8,60 кг/т и 6,23 кг/т.
13. Пределы допуска: верхний предел (в случае превышения количества на более чем 20%):
1) для проверки правильной маркировки продукта необходимо отобрать три пробы исследуемого продукта.
2) Сливочное масло и масляный жир.
Результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а средний из результатов оценивается с учетом следующего верхнего предела: 12,96 кг/т.
3) Сливки
Результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а средний из результатов оценивается с учетом следующего верхнего предела: 11,82 кг/т.
