Сравнение технологических аспектов потребности в азоте и кислороде суслом

Сравнение технологических аспектов потребности в азоте и кислороде суслом.

Сравнение потребностей сусла в азоте и кислороде были проведены компаниями, занимающимися винодельческими дрожжами. Потребность в азоте измерялась количеством аминного азота, требуемого для поддержания скорости брожения, в стационарной фазе. Потребность в кислороде измерялась скоростью анаэробной ферментации, а так же изменениями при добавлении 1 мг/дм3 кислорода, в начале брожения. В процессе работы обсуждалось технологическое влияние их существенных различий. Данные исследования могут вызвать огромный интерес у виноделов, учитывая важность азота и кислорода в технологическом процессе. Особенно, если есть вероятность медленного брожения из-за дефицита азота или вялого брожения из-за отсутствия кислорода.

Ключевые слова: медленное брожение, вялое брожение, азот, кислород, дрожжи.

Кислород и азот являются важными составляющими питательных веществ для процесса брожения. Недостаточное количество или отсутствие их может привести к медленному или вялому брожению.

Ассимилированный азот является важной составляющей синтеза протеинов. В сусле, обычно, содержится небольшое количество усвояемого азота. Существует прямая пропорциональность между концентрацией ассимилированного азота в сусле и скоростью брожения. Эффективным является добавление азота на протяжении стационарной фазы, так как он стимулирует синтез протеина особенно для транспортировки сахаров.

Дрожжи потребляют кислород для синтеза клеточных соединений, особенно для стеринов и ненасыщенных жирных кислот. Важность контроля по вопросам кислорода, добавления смесей азота и кислорода для предотвращения вялого или затухающего брожения, для эффективного брожения было недавно описано Sablayrolles и соавт. Несмотря на большое количество коммерческих компаний, занимающихся винными дрожжами, огромное влияние азота и кислорода на процесс брожения был изучен мало.

В этой статье мы рассмотрели потребности различных рас дрожжей в азоте и кислороде. Для сравнения потребности в азоте, мы сосредоточились на потребление его в течение стационарной фазы, как эта фаза имеет высокую технологическую составляющую. В виноделии, большая часть сахара усваивается после накопления дрожжами биомассы и добавление соли аммония во время этой фазы, столь же эффективно, как и добавление его в сусло. Чтобы доказать эффективность добавления азота напротяжении стационарной фазы мы ввели коэффициент брожения. Как описывалось у Manginot и соавт., скорость брожения можно регулировать напротяжении всего времени, то есть с момента начала брожения, когда концентрация сахара максимальна, до момента, когда для продолжения брожения нужно обязательно добавлять азот. Число клеток дрожжей, и, следовательно, удельная скорость брожения, остаются постоянными в течении всего процесса. Количество азота, добавленного для регулирования процесса брожения, является хорошим количественным критерием для его источника, напротяжении стационарной фазы.

Различия в потребности кислорода различными расами дрожжей сложнее. На самом деле, кислород влияет на кинетику брожения уже в самом конце, в то время как азот – напротяжении всего процесса. Кроме того, действие кислорода отличается, в зависимости от состава среды, особенно в его так называемых «анаэробных факторах роста», в основном ненасыщенных жирных кислот и стеринов. В виноделии, брожение, как правило, осуществляется практически в анаэробных условиях. Таким образом мы сравнили кинетику брожения в деаэрированной среде, без анаэробной фактора роста, с добавления небольшого количества кислорода. Это добавление было сделано в начале стационарной фазы, когда СО2 выделялся со скоростью 30 г/л.

Материалы и методы:

Условия культивирования. Штаммы дрожжей.

Винодельческие дрожжи Lallemand (Montreal, Canada), широко продаются и используются во всем мире (S1to S32). Брожение проводилось с помощью 50 мг/дм3 активных сухих дрожжей (или 106 клеток/мл).

Среда: синтетическая среда (MS 70) описана Bely и соавт., составляет сахар (200 г/дм3) и азот (его состав моделирует азот виноградного сусла).

При тестировании потребностей азота дрожжами, общее содержание азота составляло 125 мг/л, который перейдет в 100 мг/л ассимилированного азота. Скорость брожения регулировалась, как описано выше, добавлением амонийхлорида.

Когда проводились эксперименты по потребностям кислорода, была использована та же среда, только общее количество азота составляло 537 мг/л без каких либо анаэробных факторов. Среда была дэарирована аргоном, до добавления кислорода. концентрацией <40мг/л.

Так же были использованы некоторые натуральные среды из южной Франции.

Брожение: Брожение проводилось при постоянном перемешивании, при температуре 24оС, в небольших емкостях (1,2л) и замком ферментации.

Наблюдение и контроль брожения: СО2. Количество выделенного СО2 рассчитывалась по изменению веса бродящего сусла, которое контролировалось каждые 20 минут.

Скорость выделения СО2: Скорость выделения СО2 рассчитывается полиноминальным подсчетом 11 последних значений выделений СО2. Точные измерения изменений веса сусла (на 0,1 или 0,01г) позволяет точнее рассчитать количество выделенного СО2. Коэффициент отклонения (dCO2/dt)max =0,8%.

Контроль за скоростью выделения СО2( Р20-70): Напротяжении контролируемой фазы брожения, после максимального выделения СО2, скорость брожения падает, то есть после накопления 5 г/л СО2, нужно добавлять раствор аммонийхлорида, впрыскиванием, через каждые 20 минут. Эффективность добавления азота определяли построением графика зависимости добавленного азота и выделенного СО2. (Р20-70)

Добавление кислорода: Кислород добавляется в сусло при перемешивании с помощью силиконовой трубочки. (Blateyron и соавт.). Система была настроена по бездрожжевой среде.

Аналитические методы: Накопление биомассы. Популяция дрожжей характеризуются количеством клеток, которые подсчитываются с помощью электронного счетчика частиц (Coulter ZBI) и биомассы, путем измерения сухой массы. Жизнеспособность дрожжей в конце процесса брожения, измеряли методом эпифлуорисценции.

Общий азот: Образцы были минерализованы методом Кьельдаля, а аммонийный азот был определен методом спектрометрии.

Сахар: Концентрация остаточных сахаров была определена с помощью динитросалицилового реагента.

Ацетальдегид и глицерол: Ацетальдегид и глицерол были определены ферментативно. (Boehringer kit no. 69908501 and no. 68237501)

Результаты и обсуждения

Потребности в азоте. Колебания потребностей.

Потребности дрожжей в азоте были определены концентрацией аммонийного азота, нужного для запуска брожения, и поддержания его на скорости 0,72 г/л/ч, что равно максимальной скорости, достигнутой с помощью синтетического сусла, при температуре в 24 оС. Кривая добавления азота между 20 и 70 г/л СО2, была все время ровной, учитывая разницу значений, зависящую от рас дрожжей. Как показано на рисунке 1, значения колеблется от 0,96 до 2,2 мг азота/г выделенного СО2. Этот результат доказывает что потребность дрожжей в азоте зависит от штамма, особенно на протяжении стационарной фазы брожения, что было ранее описано Manginot и соавт. Штаммы имеющие самую высокую потребность а азоте, практически не содержат его. И наоборот, все дрожжи с высоким уровнем азота, содержали между 5-7 % его сухого веса. Но количество азота, которое должно содержаться в дрожжевой клетке, для поддержания скорости брожения, должно быть одинаковым, несмотря на расу. Это резюмирует результаты, полученные Bely и Manginot, которые уже описывали зависимость скорости процесса брожения от количества азота в клетках, используя дрожжи К1.

Эти наблюдения показали, что добавление азота на протяжении стационарной фазы брожения, помогает синтезировать протеин для транспортировки сахаров. Так же азот может быть добавлен другими путями. Так как ассимиляция аммонийных солей влияет на НАД баланс клеток, последствия добавления азота на выделение двух побочных продуктов, которые участвуют в окислительно-востановительных процессах, будут влиять на дрожжевые и другие винодельческие характеристики (глицерол и ацетат). Концентрации глицерола и ацетата были высокими, но это практически не повлияло на результаты исследований.

Технологическое значение нужного количества азота

Мы сбраживали синтетическое сусло, с начальной концентрацией азота 125 мг/л, без добавления азота на протяжении стационарной фазы и сравнили скорости брожения с экспериментальными значениями. Результаты на рисунке 3.

Потом, мы сравнили расы дрожжей самыми низкими и высокими потребностями в азоте, используя натуральное сусло. Натуральное сусло показала такое же количество ассимилированного азота, как и синтетическое, таким образом, скорости брожения контролировались одинаковым методом. Количество добавленного азота отличалось в синтетическом и натуральном суслах, и кривая добавления азота не была ровной (рисунок 4). Тем не менее, разница между дрожжевыми потребностями в азоте была дополнительно подтверждена при тестировании тех же штаммов, с помощью разных сусел.

Эти результаты иллюстрируют технологический интерес в эксперименте Р20-70, который предназначен для определения лучшего времени добавления СО2.

Потребности в кислороде

Изменчивость потребностей в кислороде. Оптимизация условий испытаний. Для сравнения требования дрожжами кислорода, мы провели брожения в деаэрированной среде, без анаэробной фактора роста, и в среде, с добавлением небольшого количества кислорода. Это добавление проводили в начале стационарной фазы, то есть когда выделилось 30 г/л CO2.

Прежде всего мы сравнили эффект добавления возрастающих количеств кислорода от 0,5 до 7 мг/л. Изначально, Sablayrolles и соавт., определили общую потребность дрожжей в кислороде, начиная с10 мг/л, и уменьшая концентрацию, в зависимости от расы дрожжей.

Как показано на рисунке 5, добавление 2,6 мг/л кислорода так же эффективно, как и добавление 7 мг/л или 1 мг/л, которых достаточно, для получения эффекта равносильного половине максимума. Для максимально легкого эффекта, мы решили добавлять 1 мг/л кислорода.

Сравнения штаммов, без добавления кислорода

В ходе брожения, без добавления кислорода, его количество стремительно уменьшалось. Из-за отсутствия кислорода и анаэробных факторов роста в процессе брожения, вопреки обычным условиям, было обнаружено снижение концентрации кислород, а не азота.

В независимости от штамма, количество дрожжевых клеток находилось в диапазоне от 25 до 36 * 106 клеток/мл. Количество выделения СО2, которое напрямую зависит от количества дрожжевых клеток, тоже уменьшилось, и, что интересно, оно было разным в зависимости от штамма дрожжей, и колебалось в диапазоне от 0,37 до 0,75 мг/л/час. По правде говоря, сила и скорость брожения в условиях отсутствия кислорода, зависила от штамма дрожжей, и их способностей к использованию своих липидных резервов, на стадии роста. Интересно, что в брожении с ограниченным количеством азота, разница в (dCO2/dt)max была меньше.

Сравнение штаммов дрожжей, при добавлении 1 мг/л кислорода.

Добавление 1 мг/л кислорода имело разный эффект, зависящий от штамма дрожжей, что показано на рисунках 7 и 8. Как факт, относительное увеличение количества СО2, после двух недель брожения, колебалось от 10 до 41 %. Исследования показали, что нет зависимости между полученными результатами, с и без добавления кислорода, а так же способностью дрожжей к накапливанию биомассы в отсутствии кислорода и с добавлением его.

Было найдено соотношение между количеством выделяемого СО2, в сусле без добавления кислорода, и мгновенной скоростью и количеством выделения его при добавлении кислорода. На рисунке 9, показано соотношение между (dCO /dt)max в сусле с и без добавления кислорода, и эффективность его использования.

Технологическое значение нужного количества кислорода

Для увеличения технологического интереса к данному вопросу, проводились исследования в натуральной среде. Для этого, было выбрано два натуральных сусла, склонных к медленному брожению, и две расы с противоположными показателями кинетики брожения в анаэробных условиях и с добавлением 1 мг/л кислорода (рисунок 6 и 8). В двух суслах (таблица 1), процесс брожения прошел быстрее, а жизнеспособность некоторых штаммов дрожжей осталась на высоком уровне, по сравнению с другими. Это подтверждает результаты, полученные с помощью синтетического сусла, и показывает что низкое значение (dCO /dt)max и низкая популяция, благоприятны для поддержания высокой клеточной жизнеспособности в конце брожения, что ограничивает риск вялого или медленного брожения.

Величина (dCO /dt)max, в отсутствии кислорода, судя по всему, имеет разные технологические значения. Эффективность добавления 1 мг/л кислорода, сложнее проанализировать. Это предполагает хороший контроль добавления кислорода, что является важнейшей частью, для некоторых штаммов дрожжей.

Таблица 1. Сравнение рас S2 и S11 в сусле, не подходящем для брожения
сусло	сусло 1	сусло 2
Штамм дрожжей	S2	S11	S2	S11
Продолжительность процесса брожения (час.)	-	200	235	180
Остаточный сахар (г/л)	40	<2	<2	<2
(dCO2 /dt)max (г/л/час)	1,94	1,49	1,66	1,33
Популяция дрожжей (106 клеток/мл)	95	70	100	82
Жизнеспособность дрожжевых клеток по окончанию процесса брожения	10	50	15	48

Выводы

Производственные дрожжи имеют разные потребности в азоте и кислороде. Эти два нутриента имеют большое значение в технологическом процессе виноделия и могут быть использованы, как критерии, при селлекционировании новых рас дрожжей. Определение протебностей в азоте вызывает особый интерес в случае использования сусла с его дефицитом, поскольку длительность процесса брожения в этих условиях зависит от способности дрожжей усваивать азот. Хотя ми и не стремились изучить все иные последствия в этих различиях потребностей в азоте, было обнаружено, что они не были связаны с окончательным содержанием азота дрожжей и продуктов их метаболизма, таких как глицерин и ацетат.

Потребность в кислороде является одним из важнейших факторов, при использовании сусла, склонного к вялому брожению. Его измерения достаточно сложные, но сравнения кинетики брожения в деаэрированой синтетической среде без анаэробных факторов очень интересно. В этих условиях, низкое содержание (dCO /dt)max, кажется предпочтительнее, потому что контролирование разделения клеток и липидной активности, приводит в повышению жизнедеятельности дрожжевых клеток в конце процесса брожения. Этот анализ может быть улучшен, поскольку мы не принимали во внимание тот факт, что в виноделии процесс брожения осуществляется с некоторыми (не поддающимися контролю) добавлениями кислорода, и что их эффективность (на протяжении стационарной фазы) не связана со способностью дрожжей к накапливанию биомассы в анаэробных условиях.

Улучшения введение новых анализов для измерения потребностей производственных дрожжей в питательных веществах и более точного определения способностей дрожжей к синтезу различных продуктов метаболизма, что влияют на органолептические характеристики готовой продукции, будут серьезно востребованы в будущем.