Методики экспертного исследования апрофена и тарена.
В данной работе предлагается комплексная методика качественного и количественного исследования тарена и апрофена в составе тарена. Приведены материалы ИК, УФ и масс-спектров, а также газовых и жидкостных хроматограмм.
APROPHEN; DIETHYLAMINOETHYL DIPHENYLPROPIONATE.
Входит в состав препарата – ТАРЕН.
Состав на одну таблетку: апрофена-0,025 г, вспомогательных веществ - 0,075 г. Апрофен является основной составной частью таблеток «Тарен» (состав на одну таблетку: апрофен – 0,0225 г, циклозил – 0,0015 г, хлорозил – 0,00075 г, карбахолин – 0,000125 г, глюкоза – 0,12 г, крахмал, тальк, стеарат кальция – до 0,2 г).
В последнее время отмечается значительный рост случаев немедицинского злоупотребления данного препарата.
Использование тестов «Наркоспектр»:
Для отнесения подозреваемого объекта к апрофену проводят последовательно испытания реагентами тестов Ф8, Ф16, Ф14, Ф11. При взаимодействии с реагентами теста Ф16 порция объекта составляет около двух спичечных головок, в остальных случаях - около одной спичечной головки.
В присутствии апрофена в объекте тест дает голубую окраску нижнего (хлороформного) слоя реакционной смеси, Ф8 и Ф14 - желто-зеленую окраску реакционной смеси, Ф11 - желтозеленую, переходящую в оливковую в течение 0,5-1 минуты.
1. Исследование методом газовой хроматографии с ПИД.
Исследование методом газовой хроматографии используют для качественного выявления и количественного определения психотропного вещества – апрофена в составе представленных на экспертизу веществ и таблеток.
При качественном анализе используют органические экстракты исследуемых объектов (в метаноле или в хлороформе). Исследование проводят на газовом хроматографе фирмы “Хьюлетт-Паккард” модели 5890 серии II, на капиллярной кварцевой колонке HP-1 (25 м х 0,2 мм, толщина пленки фазы - 0,33 мкм). Условия анализа: температура инжектора - 280оС, температура детектора - 290оС, температура колонки изменялась от 200оС до 280оС, со скоростью 10оС/мин. Газ-носитель - водород, детектор пламенно-ионизационный. Объём вводимой пробы 1 мкл. Пробы вводили в хроматограф в режиме с делением потока 1:40.
При количественном анализе объекта, содержащем психотропное вещество – апрофен берут точную навеску вещества или таблетки, массой 4-6 мг, добавляют 1 мл раствора метилстеарата в хлороформе с концентрацией 1 мг/мл и 1 каплю диэтиламина, интенсивно встряхивают, отстаивают и исследуют в указанных выше условиях. Времена удерживания составляют: для метилстеарата – 2,41 мин, для апрофена – 2,9 мин. Анализ проводят не менее трех раз. Затем, по результатам параллельных анализов, для объекта определяют среднее значение массовой доли апрофена (Х, %масс) и рассчитывают доверительный интервал.
В этом случае расчет количественного содержания апрофена проводят по формуле:
%, где:
Sx – площадь пика апрофена;
Sст – площадь пика внутреннего стандарта;
mст – масса внутреннего стандарта, мг;
mп – масса исходной пробы, мг;
K – соответствующий относительный массовый коэффициент.
Относительный массовый коэффициент апрофена к метилстеарату равен 0,83.
Также возможно количественное определение апрофена по построенной калибровке с использованием внутреннего стандарта. Для построения калибровки используют либо чистый апрофен, либо таблетку тарена с известным содержанием апрофена в ней. По оси абсцисс откладывают концентрации, по оси ординат – отношение площади пика апрофена к площади пика метилстеарата. Используют как минимум три калибровочных раствора с концентрациями апрофена от 1 до 5 мг/мл (мг вещества в растворе метилстеарата в хлороформе с концентрацией 1 мг/мл). Далее по калибровочной зависимости, зная отношение площади пика апрофена к площади пика метилстеарата для вещества или таблетки с неизвестным содержанием апрофена, определяют концентрацию вещества в растворе, и рассчитывают содержание вещества в таблетке или в веществе, представленном на экспертизу.
2. Исследование методом газовой хроматографии с МСД.
Подготовку пробы проводили следующим образом:
От исследуемого вещества отбирают навеску массой 0,01 г. Навеску заливают 0,4 мл дистиллированной воды, затем добавляют к полученной смеси 0,8 мл хлороформа и 0,2-0,5 мл 25% раствора аммиака. Смесь встряхивают, после полного расслоения отбирают хлороформный слой.
Полученный хлороформный экстракт анализируют на газовом хроматографе «Agilent Technologies» 6890N с масс-селективным детектором «Agilent 5973 N» в следующих условиях:
- кварцевая капиллярная колонка HP-5MS – 30 м;
- начальная температура термостата колонки – 150 0С (выдержка 3мин.);
- скорость нагрева до температуры 280 0С - 30 0С/мин (выдержка 20 мин.);
- температура инжектора – 250 0С;
- деление потока в инжекторе – 40:1;
- температура интерфейса – 280 0С;
- газ носитель гелий – 1,0 мл/мин;
- объем пробы, мкл. – 1,0.
На хроматограмме представленного объекта наблюдают пик апрофена. Типичные хроматограммы и масс-спектр апрофена приведены на рисунках …
3. Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Подготовку пробы проводят следующим образом:
От исследуемого вещества отбирают навеску массой 0,01 г. Навеску заливают 20 мл дистиллированной воды, затем к полученной смеси добавляют две капли концентрированной соляной кислоты. Полученный раствор тщательно перемешивают в ультразвуковой ванне, фильтруют и исследуют на жидкостном хроматографе «Милихром А-02».
Условия анализа:
- колонка размером 2х75 мм с обращенно-фазным сорбентом «ProntoSIL-120-5-C18 AQ);
- элюент А: 4М LiClO4-0,1М HClO4: H2O (5:95);
- элюент В: ацетонитрил;
- градиент: от 5 % В до 100 % В за 40 мин; 100 % В 3 мин;
- поток: 100 мкл/мин;
- объем пробы: 4 мкл;
- температура: 40 0С;
- детектор: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм.
Идентификацию вещества в полученных растворах осуществляют путем сравнения его хроматографических и спектральных параметров с аттестованными значениями, включенными в базу данных «ВЭЖХ-УФ» (свидетельства об аттестации Госстандарта РФ № 37-03 и года).
Затем определяют концентрацию апрофена в полученном растворе и рассчитывают содержание апрофена в составе таблетки или вещества, представленных на исследование. Содержание вещества рассчитывают по формуле:
C гр х V х 100%
Q = --------------------- , где
g
Q - содержание определяемого вещества, масс. %;
Cгр - концентрация вещества в растворе, найденная по градуировочной кривой, мг/мл;
V - объем дистиллированной воды, в котором была растворена навеска образец, мл;
g - навеска исследуемого образца, мг.
4. Исследование методом ИК-спектрометрии.
Исследование проведено с целью идентификации апрофена и определения наполнителей в составе таблеток. Для этого снимали спектр чистого апрофена и таблетки тарена, прессуя их в таблетки с бромидом калия. Для определения наполнителей осадки от частей представленных таблеток тарена отмывали раздельно этилацетатом и гексаном; метанолом; ацетоном; метанолом и хлороформом. Полученные осадки высушивали и прессовали в таблетки с бромидом калия и исследовали на ИК-Фурье спектрометре модели “Nexus FT-IR” фирмы “Thermo Nicolet”. Спектры регистрировали в режиме “пропускание” в инфракрасной области волновых чисел от 4000 до 400 см -1 при следующих условиях детектор DTGS-KBr; разрешение - 4 см -1; скорость вращения зеркала – 0,6329; количество сканирований - 64.
Полученные таким образом спектры, после обработки на программном обеспечении «OMNIC» версии 6.1а. соответствовали спектрам соответственно апрофена, тарена и глюкозы из спектральной базы данных «Hummel Polymer Sample Library». Спектр чистого апрофена приведен на рис …; спектр тарена приведены на рис …; спектры глюкозы (из отмытых осадков) приведены на рис …
5. Исследование методом УФ-спектрофотометрии.
Спектр апрофена в 0,1 н соляной кислоте приведен на рис. № 1.
Спектр апрофена в составе таблеток тарена в 0,1 н соляной кислоте приведен на рис. № 2.
Таблетки «Тарена» поступают на исследование в смеси с различными наполнителями, в качестве которых выступают сахара, крахмал, тальк, стеарат кальция и в смеси с различными добавками, в качестве которых выступают циклозил, хлорозил, карбахолин.
Наличие наполнителей таких, как сахаров, крахмала, талька и стеарата кальция в смеси не мешают определению апрофена методом УФ спектроскопии.
Добавки же, такие как циклозил, хлорозил, карбахолин в кислой среде (рН = 0 - 1) влияют на количественное определение апрофена данным методом.
Поэтому данный метод проименим лишь для веществ, содержащих апрофен и вышеуказанные наполнители.
Количественное определение апрофена методом УФ спектроскопии проводят по методике с использованием градуировочной кривой. Для построения калибровочной кривой готовят стандартный раствор апрофена гидрохлорида, растворяя точную навеску чистого вещества 40-50 мг в 50 мл 0,1 н НСl (8,3 мл HClконц.+991,7 мл H2Oдист., если % содержание кислоты в реагенте равно 37 и удельный вес реагента равен 1,19 г/мл). Из полученного таким образом стандартного раствора готовят путем разбавления не менее 4 растворов с концентрациями в интервале от 0,2 до 0,8 мг/мл. Фотометрирование растворов проводят в кварцевых кюветах толщиной 10 мм относительно 0,1 н НСl, оптическую плотность вычисляют по разности значений оптических плотностей при 258 нм (максимум поглощения) и 300 нм (минимум поглощения). При построении калибровочной кривой по оси абсцисс откладывают значение концентрации (С, мг/мл), а по оси ординат - вычисленную оптическую плотность (А).
С целью определения содержания апрофена гидрохлорида в исследуемом образце навеску 40-60 мг (g) растворяют в 50 мл (V1) 0,1 н соляной кислоты. УФ спектр полученного раствора регистрируют в тех же условиях, что и УФ спектры стандартных образцов. Затем, определив значение оптической плотности для образца, находят концентрацию (Сгр) апрофена гидрохлорида в растворе по калибровочной кривой и рассчитывают содержание вещества по формуле (1):
C гр х V1 х 100%
Q = --------------------- , где
g
Q - содержание определяемого вещества, масс. %;
Cгр - концентрация вещества в растворе, найденная по градуировочной кривой, мг/мл;
V1 - объем дистиллированной воды, в котором была растворена навеска образец, мл;
g - навеска исследуемого образца, мг.
Рис № 1.
УФ-спектр апрофена в 0,1 н соляной кислоте.
Рис № 2.
УФ-спектр тарена в 0,1 н соляной кислоте.
.
Типичная хроматограмма апрофена в этилацетате
 |
.
 |
Типичная хроматограмма апрофена.
 |
Типичная хроматограмма тарена.
 |
 |
Типичная хроматограмма тарена в хлороформе.
2500 2000
Wavenumbers(cm-l)
Апрофен
Исследование методом тонкослойной хроматографии напластине HPTLC Merck 60F254 после обработки раствором роданистого кобальта.
Рисунок 1. Хроматограмма апрофена и тарена в системе
толуол: ацетон: этанол: аммиак 45:45:7:3 и обработка раствором роданистого кобальта (Co(SCN)2). Наблюдается голубое окрашивание пятен на хроматограмме. (1. Апрофен; 2. Тарен;)
Методика приготовления раствора роданистого кобальта: 3-4 гр (Co(SCN)2) добавить 100 мл дистиллированной воды.
Значения Rf апрофена и тарена на различных пластинах.
Таблица 1.
Вещество | Толуол: Ацетон: Этанол: Аммиак 45:45:7:3 | |
SORBFIL | Merck 60 F254 | |
Апрофен | 0,87 | 0,86 |
Тарен | 0,87 | 0,86 |
Наблюдается светло-желтое окрашивание пятен на хроматограмме реактивом Марки.
Методика приготовления реактива Марки: растворяют 2 мл 36% раствора формальдегида в 10 мл концентрированной серной кислоты (реактив готовится непосредственно перед обработкой пластин).
Рисунок 2. Хроматограмма апрофена и тарена в системе метанол:солян. кислота (100:1) и обработка раствором роданистого кобальта (Co(SCN)2). Наблюдается голубое окрашивание пятен на хроматограмме. (1. Апрофен; 2. Тарен).
Рисунок 3. Хроматограмма апрофена и кокаина в системе
Хлороформ : :метанол (90:10) и обработка раствором роданистого кобальта (Co(SCN)2). Наблюдается голубое окрашивание пятен на хроматограмме. (1. Апрофен; 2. Тарен).
Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
МЕТОД: DB_2003
КОЛОНКА: II ProntoSIL-120-5-C18 AQ 2х75мм, dp = 5мкм
ЭЛЮЕНТ А: 4 М UC1O4-0.1M НС1О4 - Н2О (5:95)
ЭЛЮЕНТ Б: Ацетонитрил
ОБРАЗЕЦ: пробирка 3, 4 мкл,
БУФЕР: 0 мкл,
ДЕТЕКТОР: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, ЗООнм, Время 0.18 с, ОНВ
ТЕМПЕРАТУРА: 40.0 °С
МАКС. ДАВЛЕНИЕ: 2.0 МПа
Объем: 4.О мкл
Разведение: 1.00
КОЛОНКА: ProntoSIL-120-5-C18 AQ
Размер: 2.0x75 mm
Номер: 11
ПОДВИЖНАЯ ФАЗА:
А: 4 М LiC104-G. lM HC104 - Н20 (5:95)
В: Ацетонитрил
Скорость подачи: 100 pL/min Температура: 40 С Давление: 2.0 МРа
Параметры распознавания по спектрам:
Доверительное окно объема удерживания: 10.0%
Метод вычисления спектров: Средний по пику
Число эталонных спектров в базе: 251
|
 |
Номер пика: 1
Гомогенность: 100%
Объем удерживания гмкл: 2296
Идентификация по спектру положительная:
Название Объем, p. L Угол, ° Концентрация Апрофен 2274 0.4 0.2 87±0.029мкг/мкл
Спектральные отношения (относительно канала 21Опт): Название 220пт 230пт 240пт 250пт 260пт 280пт ЗООпт Пик 1 0.418 0.132 0.039 0.019 0.020 -0.000 0.000 Апрофен 0.409 0.131 0.040 0.019 0.021 0.001 0.001
Infra-red Spectrum. Principal peaks at wavenumbers 815. 1492. 699. 953. 1075. 840 cnr! (KBr chsk). Mass Spectrum. Principal ions at m/z 58, 70, 318, 316, 317,193, 319.161.
Quantification
. ...i^matggraphy. in Diasma: zimeiame ana norzimeiaine. limit of detection 5 U2/L. £CD—G. Cailleet al. Clin. Pharmacokinet.,1983. 8, 530-540.
Нюн performance liquid сн romaic graph Y. In olasma: zimeldine and norzimeidine, limits of detection 1.5 ua/L and 0.7 ug/L, respectively, UV detection—D. Westerlund and E. Erixson,7. Chromatogr.,1919, 185, 593-603. In plasma: limit of detection 5 ug/L—T. Visser et al. J. Chromatogr.,1984, 3091, 81-93.
Disposition in the Body. Readily absorbed after oral administration and rapidly demethylated by first-pass metabolism to norzimeidine which is active. Other metabolites include zimeldine TV-oxide and 3-(4-bromophenyl)-3-(3-pyridyl)acrylic acid; very little unchanged drug is excreted in the urine.
therapeutic concentration
Following a single oral dose of 100 mg to 10 subjects, peak plasma-zimeldine concentrations of 0.048 to 0.164mg/L (mean0.10) were attained in 2 to3 hand peakplasma-norzimeldine concentrations of 0.012to 0.092mg/L (mean 0.04) were attained in 1.5 to 8 h [G. Cailleef al, Clin. Pharmacokinet,,l983, 8, 530-540].
Following oral doses averaging 225 mg daily, given twice a day to 8 subjects, steady-state plasma concentrations of 0.029 to 0.102 mg/L (mean 0.07) of zimeldine and 0.145 to 0.554 mg/L (mean 0.25) of norzimeidine were reported. The corresponding steady-state concentrations in cerebrospinal fluid were 0.003 to 0.007 (mean 0.006) and 0.027 to 0.072 (mean 0.043) for zimeldine and norzimeidine, respectively [H. M. Calil et al.,Clin. Pharmacol 7Йел,1982, 31,
522-527].
toxicity. Zimeldine has been withdrawn from use because of potentially severe neurological side-effects. Recovery within 48 h of ingestion of 3 g of zimeldine together with half a bottle of vodka has been reported. The following postmortem tissue distribution was reported in a female subject who had been receiving 300 mg of zimeldine daily and had been found drowned: blood, zimeldine 0.3 mg/L, norzimeidine 0.9 mg/L; bile, zimeldine
18.01.2005
