Белорусский государственный университет

УТВЕРЖДАЮ

Декан биологического факультета

________________

«____» ____________ 2010 г.

Регистрационный № УД-______/уч.

Введение в биохимический эксперимент

Учебная программа для специальности:

1-31 01 01 Биология

специализации 1-31 01 01 05 Биохимия

2010 г.

Составитель:

Михаил Васильевич Шолух, ведущий научный сотрудник Научно - исследовательской лаборатории «Биохимия обмена веществ» Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук, доцент

Рецензенты:

Сергей Борисович Бокуть, заведующий кафедрой биохимии и биофизики Учреждения образования «Международный государственный экологический университет имени », кандидат биологических наук, доцент;

Анатолий Николаевич Евтушенков, заведующий кафедрой молекулярной биологии Белорусского государственного университета, доктор биологических наук, профессор

РЕКОМЕНДОВАНА К УТВЕРЖДЕНИЮ В КАЧЕСТВЕ УЧЕБНОЙ:

Кафедрой биохимии Белорусского государственного университета

(протокол № 1 от 26 января 2010 г.)

Учебно-методической комиссией биологического факультета Белорусского государственного университета (протокол № 6 от 4.02. 2010 г.).

Ответственный за редакцию: Михаил Васильевич Шолух

Ответственный за выпуск: Михаил Васильевич Шолух

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Цель и задачи спецкурса «Введение в биохимический эксперимент»:

Цель:

Сформировать у студентов современные представления о методологии биохимического эксперимента

Задачи:

1) Научить планированию, организации и проведению биохимического эксперимента и представлению экспериментальных данных.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

2) Ознакомить с методами работы с лабораторными животными, подготовкой био-препаратов для биохимического исследования, требованиями, предъявляемыми к реагентам и растворам.

3) Дать глубокие знания об основных используемых в биохимии физико-химических методах.

В результате изучения дисциплины обучаемый должен:

знать:

– особенности методологии современного биохимического эксперимента;

– правила планирования, организации, проведения биохимического эксперимента и представления экспериментальных данных;

– методы работы с лабораторными животными, подготовки биопрепаратов для биохимического исследования, требования, предъявляемыми к реагентам и растворам;

– методы выделения и очистки биополимеров;

– принципы, возможности и особенности применения различных спектральных методов анализа;

– принципы, возможности и особенности применения радиоизотопных и иммунохимических методов;

уметь:

– планировать биохимический эксперимент;

– корректно работать с лабораторными животными;

– осуществлять правильный выбор и последующее применение соответствующих методов биохимического анализа;

– использовать современные методы анализа для решения научных и практических проблем биохимии;

Изучение курса проводится по блочно-модульному принципу с выделением семи основных блоков (модулей). 1. Объект исследования в биохимическом эксперименте.

2. Методы фракционирования и разделения биоматериала. 3. Физико-химические мето-ды анализа белков и нуклеиновых кислот. 4. Хроматографические методы. 5. Электро-форетические методы анализа. 6. Спектральные, радиоизотопные и иммунохимичес-кие методы анализа. 7. Методы планирования эксперимента в биохимических исследо-ваниях. Способы обработки и презентации данных.

При чтении лекционного курса необходимо применять наглядные материалы в виде таблиц и рисунков для графопроектора, мелового рисунка, а также использовать технические средства обучения для демонстрации слайдов, презентаций.

Для организации самостоятельной работы студентов по курсу следует использовать современные информационные технологии: разместить в сетевом доступе комплекс учебных и учебно-методических материалов (программа, методические указания к лабораторным занятиям, список рекомендуемой литературы и информационных ресурсов, задания в тестовой форме для самоконтроля и др.).

Лабораторные занятия предусматривают освоение методов гомогенизации, центрифугирования, расчеты рН и концентрации буферных растворов, спектрофотометрических и спектрофлуориметрических методов, применение статистической обработки и презентации данных. В случае демонстрационных занятий – обеспечение концептуальными моделями, слайдами, программами.

Эффективность самостоятельной работы студентов целесообразно проверять в ходе текущего и итогового контроля знаний в форме устного опроса, написания рефератов, решения задач, тестового компьютерного контроля по темам и разделам курса (модулям). Для общей оценки качества усвоения студентами учебного материала рекомендуется использование рейтинговой системы.

Программа учебного курса рассчитана максимально на 96 часов, в том числе аудиторных – 32 часа: 26 часов лекций, 6 часов лабораторных занятий и 2 часа контроля самостоятельной работы студентов (КСР).

ПРИМЕРНЫЙ ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН

№

разделов

и тем

Наименование разделов и тем

Аудиторные часы

Всего

Лекции

Лабора-торные занятия

КСР

Введение

2

2

Объект исследования в биохимическом эксперименте

2

2

Подходы к биохимическому эксперименту

2

2

Требования, предъявляемые к реагентам и растворам. рН - метрия

6

2

2

2

Методы подготовки биоматериала к биохимическому исследованию

4

2

2

Методы разделения - центрифугирование

4

2

Хроматографические методы

6

4

Электрофоретические методы анализа

4

2

Спектральные методы анализа

4

2

Изотопные методы в биохимии

2

2

Способы обработки и презентации данных биохимического эксперимента

4

2

2

ИТОГО:

32

24

6

2

Содержание учебного материала

1. ВВЕДЕНИЕ

Эксперимент и наблюдение как основные формы эмпирического исследования в науке. Основные виды эксперимента. Современные представления об эксперименте, способах его планирования и проведения. Постановка цели и задач. Основные этапы эксперимента. Зависимость характера биохимического эксперимента и применяемых методов исследования от уровня изучения жизненных явлений. Организация биохимического эксперимента.

2. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Растительные, животные и микробиологические объекты. Культура клеток. Методы работы с лабораторными животными. Порядок проведения процедур на животных: подготовка животных к эксперименту; методы фиксации; обезболивание. Уход за животными в послеоперационном периоде. Способы введения фармакологических препаратов. Способы взятия крови. Способы лечения лабораторных животных. Гуманность в обращении с животными.

3. ПОДХОДЫ К БИОХИМИЧЕСКОМУ ЭКСПЕРИМЕНТУ

Исследования «in vivo» и «in vitro» - решаемые цели и задачи. Множественность факторов, влияющих на результаты опыта. Основные источники неопределённости и ограничения в биохимических исследованиях «in vivo» и «in vitro» . Подготовка медико-биологических препаратов для биохимического исследования. Необходимость работы на холоде и фиксация замораживанием. Источники неопределённости на этапе подготовки препаратов к исследованию.

4. ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К РЕАГЕНТАМ И РАСТВОРАМ.

РН - МЕТРИЯ

Техника приготовления растворов. Способы фильтрации. Мембранная фильтрация и диализ. Условия хранения растворов биохимических реагентов и биообразцов. Буферные растворы. Изотонические солевые растворы. Значение поддержания постоянства рН среды. Буферная емкость растворов. Принцип работы рН-метра. Электроды стандартные, сравнения, селективные (устройство, принцип работы, назначение, производство измерения).

5. МЕТОДЫ ПОДГОТОВКИ БИОМАТЕРИАЛА К БИОХИМИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ

Получение клеток и определение их жизнеспособности. Выбор ткани и среды для получения субклеточных препаратов. Способы разрушения клеток и тканей. Гомогенизация. Растирание с твёрдыми материалами. Разрушение в жидких средах. Блендеры и гомогенизаторы, особенности использования. Разрушение клеток с помощью ультразвука. Прочие методы разрушения клеток. Источники неопределённости на этапе разрушения тканей.

6. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ - центрифугирование

Принцип седиментационного разделения. Основные характеристики осаждаемых частиц. Аналитическое и препаративное центрифугирование. Дифференциальное, зонально-скоростное и изопикническое центрифугирование. Типы роторов и решаемые на них задачи. Прерывистый, непрерывный и самоформирующийся градиент. Формирование и извлечение градиентов. Классификация центрифуг и их применение. Методы анализа субклеточных фракций. Оценка фактора обогащения и «выхода». Документирование полученных результатов. Источники неопределённости при центрифугировании. Допущения, обычно принимаемые в методах определение субклеточной локализации ферментов. Рекомендации по уменьшению неопределённости на этапе подготовки препаратов к биохимическому исследованию.

7. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Физико-химические основы хроматографического разделения веществ. Адсорбционная хроматография. Распределительная хроматография: жидкостная, бумажная, тонкослойная, газожидкостная. Ионообменная хроматография, гель-фильтрация, аффинная (биоспецифическая) хроматография, гидрофобная хроматография. Виды хроматографических сорбентов. Особенности колоночной хроматографии. Хроматография высокого давления. Автоматизация хроматографического процесса. Оформление и обработка результатов хроматографического анализа. Ограничения и неопределенности при использовании хроматографического метода в биохимии.

8. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Принцип электрофоретического разделения веществ в жидкой среде. Виды электофореза: а) на бумаге; б) в агаровом и крахмальном гелях, в)принцип разделения молекул при электрофорезе в полиакриламидном геле. Зональный и диск-электрофорез. Изоэлектрофокусирование. Иммуноэлектрофорез. Методы детекции белков и нуклеиновых кислот после электрофоретического разделения. Методы количественной обработки результатов. Оформление результатов. Преимущества и недостатки электрофоретического метода.

9. СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Теоретические основы фото- и спектрофотометрии. Фотоэлектрические колориметры и спектрофотометры: принцип работы, область применения, классы точности, производство измерения. Типы спектров(разностные спектры, спектры действия) и их применение в исследовании биологических явлений. Качественный и количественный спектрофотометрический анализ. Количественное определение активности ферментов и кинетический анализ. Спектрофлуориметрия. Общая теория флуоресценции. Аппаратура для измерения флуоресценции. Метод флуоресцентных зондов. Применение флуорисцентных методов анализа для изучения белков и нуклеиновых кислот. Люминесцентные методы анализа. Турбидиметрия и нефелометрия. Атомная абсорбционная спектрофотометрия – принцип метода, аппаратура, применение. Динамическое лазерное светорассеяние. Электронный парамагнитный резонанс. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. Краткая характеристика метода масс-спектрометрии и получения спектров. Применение методов круговой дихроизм (КД) и дисперсии оптического вращения (ДОВ) в качестве методов исследования оптически активных веществ. Ядерный магнитный резонанс – основы теории и применение для изучения структуры биомолекул. Принципы и основы рентгеноструктурного анализа.

9. ИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ В БИОХИМИИ

Радиоактивные изотопы, используемые в биохимии. Время полураспада. Бета-распад. Распад с испусканием Х-лучей. Принцип работы жидкостного сцинтилляционного счетчика. Счёт двойной метки. Определение эффективности счёта. Регистрация Х-лучей. Методы регистрации, основанные на использовании фотоэмульсий. Радиоиммунологический анализ. Применение изотопов для определения активности ферментов и исследования путей метаболизма. Использование радиоизотопов в фармакологии. Метод изотопного разбавления. Вопросы техники радиационной безопасности.

10. СПОСОБЫ ОБРАБОТКИ И ПРЕЗЕНТАЦИИ ДАННЫХ БИОХИМИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТА

Основные методы статистической обработки результатов. Представление результатов в таблицах, графиках, диаграммах. Современные средства программного обеспечения для обработки и презентации данных биохимического эксперимента

ЛИТЕРАТУРА

Основная:

1. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / . М.: Наука, 1985. – 152 с. (http://www. plib. ru/library/book/14592.html)

2. Физико-химические методы исследования биополимеров и низкомолекулярных веществ. М.: Наука, 1992. – 231 с.

3. Физико-химические методы биохимии / , . Киев: Наукова думка, 1983. – 241 с.

4. Экспериментальные методы в исследовании белков и нуклеиновых кислот. М.: МГУ, 1985. – 182 с.

5. Методы практической биохимии / Б. Уильямс, К. Уилсон. М.: Мир, 1978. – 326 с. ( http://www. plib. ru/library/book/14309.html)

6. Планирование эксперимента / , . Мн. : БГУ, 1982. – 109 с.

7. Математические метода планирования эксперимента в химических, технических и медико-биологических исследования. Киев: Наукова думка, 1974. – 125 с.

Дополнительная:

1. Фотохимия люминесцентных белков / . М.: Наука, 1965. – 241 с.

2. Лабораторные животные / . Киев: Наукова думка, 1974. – 231 с.

3. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применения / П. Ригетти. М.: Мир, 1986. – 141 с. ( http://www. plib. ru/library/book/14233.html )

4. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов / , , . Л.: ЛГУ, 1971. – 195 с.

5. Маурер Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. – 204 с.

6. Гель-хроматография / А. Деттерман. М.: Мир, 1999. – 321 с.

7. Методы очистки белков / Р. : Мир, 1985. – 345 с. (http://www. plib. ru/library/book/14308.html)

Источники информации в Internet:

1.  Гармаш в спектроскопические методы анализа. Оптические методы анализа http://nehudlit. ru/1/1296/

2.  Жучиков . Теория и практика разделения суспензии http://nehudlit. ru/1/799/

3.  Остерман и ультрацентрифугирование (практическое пособие). Методы исследования белков и нуклеиновых кислот http://www. plib. ru/library/book/14619.html

4.  финная хроматография http://www. plib. ru/library/book/14082.html

5.  изическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии http://www. plib. ru/library/book/14566.html

6.  ысокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии http://nehudlit. ru/1/1123/

7.  адиоиоиммунологические методы http://nehudlit. ru/1/739/