Научно – практическая конференцият «Первые шаги в науку»
«Смертельный угар?
Качественное и количественное обнаружение
карбоксигемоглобина
в трупной крови человека»
Химическая секция
Выполнила
учащаяся 9 класса
Руководитель
ГУО «Гимназия №10 г. Гомеля»
2017
Оглавление
1. Введение …………………………………………………..……3
1.1. Литературный обзор…………………………………….5
1.1.1 Источники угарного газа…………………….….5
1.1.2 Воздействие на организм окиси углерода………5
1.1.3 Профилактика отравления окисью углерода…...6
1.1.4 Методы определения моноокиси углерода……..6
2. Основная часть ………………………………….……………….8
2.1. Экспериментальная часть.
Качественное обнаружение……………………….……...8
2.1.1. Опыт №1. Реакция с танином.
Проба Кункеля — Ветцеля..................................8
2.1.2 Опыт №2. Реакция с формальдегидом.
Проба Либмана………………………………..... 8
2.2. Экспериментальная часть.
Количественное обнаружение…………………………..9
3. Заключение……………………………………………….....…..12
3.1 Точки роста……………………………………………… 13
Список использованных источников и литературы……………..14
Приложение………………………………………………….….....15,16
1. Введение
Он коварен, виновник несчастий, яд повседневного действия воздействует, в первую очередь, на центральную нервную систему. Люди не замечают вторжения - ведь у захватчика нет ни запаха, ни цвета и человек не в состоянии оценить, что с ним происходит что-то не то…
Да - да, речь идет об отравляющем веществе, которое носит разные имена - оксид углерода (II), монооксид углерода, окись углерода, угарный газ, СО.
Отравление угарным газом — острое патологическое состояние, развивающееся в результате попадания СО в организм человека и животных, является опасным для жизни и здоровья, и без квалифицированной медицинской помощи может привести к летальному исходу.
В условиях современного интенсивного развития техники, промышленности, транспорта, широкого использования в производстве и быту окись углерода становится одним из вредных факторов окружающей среды. В связи с этим изучение отравлений угарным газом и его токсикологии является в настоящее время важной и актуальной проблемой. В связи с этим опасности отравления подвергаются на производстве рабочие многих специальностей; лица в очаге пожара; шоферы при неисправной выхлопной системе двигателя, экипажей и пассажиров летательных аппаратов при попадании отработанных газов двигателей в салоны и кабины; шахтеры, регулировщики уличного движения.
Токсической концентрацией для человека является 3*10-3 г/л в течение часа (условность данных определяется ндивидуальной чувствительностью организма) [3,7].
Т. о. в крови лиц, отравленных оксидом углерода (II), содержится гемоглобин и его соединения, к числу которых относятся: гемоглобин, не связанный с кислородом и оксидом углерода (II), или так называемый (Hb), (HbO2) — гемоглобин, связанный с кислородом, и (HbCO) — гемоглобин, связанный с оксидом углерода (II). Кроме того, в крови может содержаться некоторое количество метгемоглобина (MtHb). Угарный газ (CO) активно связывается с оксигемоглобином (НbО2) и дезоксигемоглобином (Hb), образуя прочное соединение карбоксигемоглобин (HbCO). CO связывается и отчасти, с миоглобином мышц. НbО2 + CO ↔ НbСО + О2 и Нb +СО ↔ НbСО.
Некоторые процессы приводят к окислению иона железа (+2) в гемоглобине до степени окисления (+3). В результате образуется форма гемоглобина, известная как МtHb - производное гемоглобина, лишенное способности переносить кислород в связи с тем, что железо гема находится в трехвалентной форме; образуется в повышенном количестве при некоторых наследственных болезнях и отравлениях. Блокируются процессы транспортировки кислорода, что приводит к гипоксии. НbСО искусственно разрушается медицинским путём, а также он диссоциирует на СО и Нb естественным путём, период полураспада - 4-6 часов. Это возможно, если его содержание в крови мало, и жизнедеятельность организма не нарушается [1].
Объектом исследования является – трупная кровь человека (из бедренной вены).
Предмет исследования – карбоксигемоглобин крови.
Место проведения исследования – лаборатория судебно – медицинской экспертизы. Участие в экспертизе на этапе обнаружения качественного и количественного содержания карбоксигемоглобина в трупной крови.
Гипотеза: предполагается, что летальный исход наступил от отравления угарным газом и данный образец содержит карбоксигемоглобин.
Цель: качественное и количественное обнаружение карбоксигемоглобина в трупной крови человека.
Задачи: - изучить научно-популярную литературу по теме;
- изучить способы качественного и количественного обнаружения СО в крови;
- ознакомиться с принципом работы спекторофотометра;
- провести качественный и количественный анализ содержания карбоксигемоглобина в крови;
- при помощи результатов кривых спектрофотометра подтвердить или опровергнуть гипотезу исследования;
- выступить с полученными данными перед учащимися с целью осознания ими необходимости соблюдать правила безопасного поведения в условиях задымления и т. п.
Тип проекта: экспериментальный, межпредметный (химия и биология).
Формы представления результатов проекта: доклад по теме исследования, компьютерная презентация.
1.1. Литературный обзор
1.1.1 Источники угарного газа
Один из источников угарного газа - сам человек. Количество природного угарного газа, по некоторым данным, составляет только около 3% от газа из антропогенных источников, на 90% получаемого за счет сжигания ископаемого топлива. Естественный уровень СО в воздухе - 0,01 - 0,9 мг/м3, а на автострадах мегаполисов средняя концентрация СО составляет до 57 мг/м3, превышая порог отравления. Основным «поставщиком» монооксида углерода в крупных городах является автотранспорт. Курильщик вдыхает при выкуривании одной сигареты 18,4 мг СО [5].
1.1.2 Воздействие на организм окиси углерода
Попадая в легкие и оттуда в плазму крови СО проникает в эритроциты и там взаимодействует с белком гемоглобином - переносчиком кислорода от легким к тканям. Каждая молекула Нb содержит четыре гема, в центре которых находится атом железа (II), способный обратимо присоединять молекулу кислорода, образуя НbО2. Именно на атом железа и нацеливается CO, образуя комплексное соединение, неспособное переносить кислород. В конкуренции за Нb угарный газ имеет выраженное преимущество перед кислородом - он быстрее реагирует с Нb и образует более прочное, чем НbО2, соединение. Впрочем, монооксид углерода может быть частично вытеснен из гема при повышении парциального давления кислорода в лёгких. Кровь разносит отравляющее вещество по всему организму, и оно фиксируется в различных органах вследствие сорбционной емкости. Кроме того, диссоциация HbCO в крови проходит очень медленно, и он постепенно накапливается[4,7].
1.1.3 Профилактика отравления окисью углерода
Соблюдать правила техники безопасности при топке печей и т. п., держать автомобиль с выключенным двигателем в закрытом пространстве, в автопробках; проветривать кухни, оборудованные газовыми плитами. Как можно больше бывать на свежем воздухе, избегая прогулок по загруженным магистралям, особенно рядом с автомобильными пробками; не курить и не разрешать курить рядом с собой[5].
1.1.4 Методы определения моноокиси углерода
При подозрении на отравление угарным газом кровь исследуется на присутствие HbCO. Обнаружение карбоксигемоглобина в крови является доказательством отравления оксидом углерода (II). Для обнаружения и количественного определения карбоксигемоглобина используются: спектроскопические, химические, фотоколориметрические, спектрофотометрические, газо-хроматографические и др. методы. Существуют методы качественного (1) и количественного (2) обнаружения СО[1,4]:
1) Описанные до настоящего времени химические методы качественного обнаружения оксида углерода (II) в крови основаны на сравнении окрасок нормальной крови и крови, содержащей карбоксигемоглобин, которые возникают после прибавления соответствующих реактивов. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, от прибавления перечисленных ниже реактивов не изменяет или только незначительно изменяет свою окраску, а нормальная кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, под влиянием этих реактивов значительно изменяет свою окраску. Из известных качественных реакций особенно широко применимы пробы с таннином и формалином из-за резко отличающихся цветов в двух пробах.
Заключение о наличии HbCO в крови базируется на основании результатов этих реакций. При легкой степени отравления оксидом углерода (II) в крови содержится незначительное количество HbCO и с перечисленными реактивами будет давать такие же реакции, которые дает кровь, не содержащая HbCO. В связи с этим описанные реакции малопригодны для обнаружения малых количеств HbCO в крови.
2) Лучшим способом стандартизации гемоглобина крови считается спектрофотометрический. Все указанные соединения количественно можно обнаружить по их спектрам поглощения в видимой области в пределах длин волн от 450 до 620нм. Значительно отличаются друг от друга спектры поглощения Нb и НbСО, по которым Hb имеет 1 максимум светопоглощения при длине волны, равной 557 нм, а карбоксигемоглобин имеет 2 максимума светопоглощения при длинах волн 541 и 571 нм (Приложение 1).
В практической деятельности лабораторий спектрофотометр используется для количественного определения веществ по методам, основанным на законах светопоглощения, которые являются общими для фотоколориметрических и спектрофотометрических измерений; для измерения оптических плотностей и коэффициентов пропускания образцов в монохроматическом свете, т. е. в очень узком интервале длин волн. Целесообразность метода спектрофотометрии получила подтверждение при экспертизе отравления окисью углерода даже при исследовании крови и жидкости из трупов, эксгумированных спустя несколько месяцев после погребения (210 дней) [1,2]. В результате использования монохроматического света зависимость поглощения света от концентрации является более прямолинейной. Для этих целей снимаются характеристические спектры поглощения чистых веществ, которые являются индивидуальными для каждого вещества. Полученные при исследованиях записи спектров поглощения, при сравнении с уже известными, позволяют не только идентифицировать вещество, но и обнаружить наличие примесей, что существенно при исследовании различных биологических препаратов. Обладая высокой чувствительностью и избирательностью, спектрофотометры позволяют вести определение ряда веществ в смесях, без их отделения, что значительно упрощает анализ [4,7].
2. Основная часть
2.1. Экспериментальная часть. Качественное обнаружение
Предварительно учителем и лаборантом проведен инструктаж учащейся по правилам безопасного поведения в химической лаборатории. В связи с самостоятельным приготовлением некоторых растворов и опасных для жизни и здоровья соединений, особое внимание обращалось на меры безопасности с формалином, угарным газом, конц. кислотами, щелочами и работа под вытяжным шкафом.
При выполнении всех описанных ниже качественных реакций на наличие HbCO параллельно проводили два опыта. Для выполнения первого опыта брали нормальную кровь, для второго— кровь, предполагаемо отравленную оксидом углерода (II). К пробам нормальной крови и крови, содержащей HbCO, прибавляли одинаковые объемы реактивов и наблюдали изменения, которые произошли в обеих пробах под влиянием реактивов.
2.1.1 Опыт №1. Реакция с танином (проба Кункеля — Ветцеля).
Оборудование: кровь, дист. вода, 3 мл 30% таннина.
Методика: кровь разбавляю пятикратным объемом дистиллированной воды. В пробирку вношу 5 мл раствора крови, прибавляю 15 мл 30 % водного раствора танина, а затем содержимое пробирки хорошо взбалтываю. Из крови, содержащей карбоксигемоглобин, выпадает светлый карминово-красный осадок, а из крови, не содержащей карбоксигемоглобина, выпадает серовато-коричневый осадок. Результат реакции не менее, чем через 12ч показал светлый карминово-красный осадок в исследуемой крови, что подтверждает наличие в ней карбоксигемоглобина.
2.1.2 Опыт №2. Реакция с формальдегидом (проба Либмана).
Оборудование: кровь, 1 мл 37% формалина.
Методика: К 5 мл неразбавленной крови прибавляют 5 мл формалина (37 % раствор формальдегида) и сильно взбалтываю. Кровь, содержащая карбоксигемоглобин, сохраняет красную окраску, а кровь, не содержащая карбоксигемоглобина, через несколько минут становится коричневато-черной.
Результат реакции не менее, чем через 5ч показал, что образец исследуемой крови не изменил свою окраску [2,4,8].
Вывод: изменение в оп. №1 и сохранение в оп. №2 окраски проб крови в результате качественных реакций свидетельствует о наличии карбоксигемоглобина.
2.2. Экспериментальная часть. Количественное обнаружение
Спектрофотометрические методы позволяют вести измерения в узкой области спектра — в области максимального поглощения, что увеличивает чувствительность и повышает точность количественного определения. Растворы HbCO ярко-красного цвета, их спектр поглощения характеризуется двумя полосами поглощения в желто-зеленой области видимой зоны спектра (λ= 579 - 564 и 548 - 530 нм) и двумя максимумами (пиками) при длине волны 571 и 541 нм. Hb имеет один максимум светопоглощения при длине волны, равной 557 нм [1,4,9].
Оборудование: вытяжной шкаф с сильной тягой, кровь, гидросульфит натрия (дитионит), 0,1 % NH4OH, конц. серная кислота, 10% NaOH, муравьиная кислота, дист. вода, спектрофотометр Cary – 50.
Методика: Поступивший в организм оксид углерода (II) связывается с дезокси - и оксигемоглобином, вследствие чего образуется карбоксигемоглобин (HbCO). Метгемоглобин не связывается с оксидом углерода (II) в крови. Однако в лабораторных условиях при помощи дитионита натрия (гидросульфит натрия), (Na2S2O4 ·2H2O) MtHb переводится в Hb. На основании экспериментальных данных эта наибольшая разница значений оптических плотностей растворов HbCO и Hb имеет место при длине волны, равной 538 нм [1,4,6].
Для количественного спектрофотометрического определения CO по HbCO приготовляю ряд растворов: раствор А — раствор исследуемой крови; раствор Б — раствор крови, содержащей смесь HbCO и Hb; раствор В — раствор крови, в которой все формы гемоглобина (Hb, HbO2 и MtHb) полностью переведены в HbCO. Учитывая высокую токсичность CO, при работе с ним необходимо соблюдать осторожность. Получение CO и насыщение крови этим газом производится в вытяжном шкафу с хорошей тягой.
1)Готовлю рабочий раствор А (раствор исследуемой крови, содержащей предполагаемо все виды гемоглобина): 1мл трупной крови (без сгустков) в мерную колбу на 100мл и прибавляю буферный раствор 0,1 % NH4OH. Взбалтываю. Фильтрую. Для фотометрирования приготовленный раствор должен быть прозрачным.
2)Готовлю раствор В. Исследуемый образец крови содержит предполагаемо все виды гемоглобина, в т. ч. метгемоглобин, который необходимо восстановить до дезоксигемоглобина, а затем, насыщая окисью углерода в карбоксигемоглобин последующей схеме : А→ Б → В → Г
А – в колбу вносят 50 мл конц. серной кислоты и в капельную воронку этой колбы 10 мл муравьиной кислоты (приливание HCOOH по каплям).
Б – колба с 10% раствором NaOH
В – колба с дист. водой
Г – пробирка с исследуемой кровью (раствор А)
Все емкости сообщены между собой стеклянными трубками. В склянки Б и В вносится столько жидкостей, чтобы трубки погружались на 2см в жидкость.
Скорость выделения CO регулируется быстротой приливания муравьиной кислоты. По мере расходования HCOOH выделение газа замедляется. Получаемый CO пропускается через склянки в течение 15 мин. За это время оксигемоглобин крови полностью превращается в карбоксигемоглобин. Однако при этом в растворе может оставаться некоторое количество MtHb, который необходимо перевести в Hb, а затем в HbCO. С указанной целью после 15 – минутного пропускания газа от прибора отсоединяю пробирку Г, в которую вношу 5-7 мг дитионита (ни Hb, ни HbCO c дитионитом не реагируют). Взбалтываю. Затем пробирку вновь подсоединяю к системе и в течение 5 мин пропускаю еще окись углерода. После насыщения раствор карбоксигемоглобина должен быть также прозрачным.
3)Готовлю раствор Б. Этот раствор готовлю непосредственно в кювете спекторофотометра перед измерением оптической плотности раствора.
В кювету спектрофотометра с толщиной слоя жидкости 1 см вношу исследуемый раствор крови (раствор А), прибавляю 3- 4 мг дитионита натрия для установления восстановленного дезоксигемоглобина. Перемешиваю стеклянной палочкой. Оптическую плотность этого раствора измеряют при длинах волн, равных 538 и 550 нм.
Затем измеряю оптическую плотность раствора крови, в которой весь гемоглобин переведен в карбоксигемоглобин (раствор В), при длине волны 538 нм. На основании экспериментальных данных наибольшая разница значений оптических плотностей растворов карбоксигемоглобина и дезоксигемоглобина имеет место при длине волны, равной 538 нм. При измерении оптической плотности обоих растворов крови раствором сравнения является вода.
(DCOHb – DHbCOHb) *100
Р = 100 - ---------------------------------- , где
DHbи *К
Р – содержание карбоксигемоглобина (%);
DCOHb - оптическая плотность раствора В крови, дополнительно насыщенного СО (при λ = 538 нм);
DHbCOHb - оптическая плотность раствора Б крови, обработанного дитио-нитом, содержащего смесь дезокси - и карбоксигемоглобина (при λ = 538 нм);
DHbи - оптическая плотность раствора Б крови в изобестической точке при λ = 550 нм. Изобестическая точка характеризуется одинаковым светопоглощением всех компонентов раствора. В этой точке оба окрашенные соединения имеют одинаковое светопоглощение, так что их кривые светопоглощения пересекаются.
К – коэффициент 0, 372 (зависит от оптической плотности растворов при λоптим).
Величина ошибки определения HbCO в пределах концентраций от 3-20% составляет ± 3%, при концентрациях свыше 20% - ± 5% [3,4,9].
Так, при снятии спектров, если наблюдаются кривые с двумя пиками, то это свидетельствует о наличии карбоксигемоглобина в растворе.
Полученные результаты измерений рассчитываются в компьютерной программе и результат в %СOHb к общему количеству Hb составил в нашем случае 60%. Данный высокий процент является смертельной концентрацией НbCO в крови (не менее 60%), но может колебаться от 40 до 80% и более. Этот интервал обусловлен как влиянием внешних условий, так и индивидуальными особенностями организма.
3. Заключение
В ходе выполнения работы были выполнены поставленные задачи, работающие на единую цель, но и в то же время намечены новые точки роста.
Мною изучена литература по данной теме. На базе химической лаборатории проведено качественное и количественное обнаружение карбоксигемоглобина, подтверждающие гипотезу, что летальный исход наступил от отравления угарным газом и предоставленный образец содержит смертельный процент (60%) карбоксигемоглобина (Приложение 2).
Данная работа имеет большое практическое значение и интересна широкому кругу слушателей. Так, имели место выступления с полученными данными перед учащимися с целью осознания ими необходимости помнить о коварности свойств угарного газа при задымлениях, пожарах и т. п. (например, на гимназической предметной неделе химии и биологии).
Согласно вышеизложенных методик: в ходе выполнения опытов по качественному обнаружению - карбоксигемоглобин был выявлен, но при наличии в крови HbCO в малых количествах актуальным является спектрофотометрический метод количественного содержания. В результате приготовления рабочих трех растворов, снятии их спектров, наложении их в единый график и обработке в ЭВМ, получены данные о содержании 60% ±5% карбоксигемоглобина в данном образце.
Т. о. гипотеза подтверждена, что летальный исход наступил от отравления угарным газом и предоставленный образец содержит карбоксигемоглобин.
3.1. Точки роста
Определить содержание карбоксигемоглобина в крови и сравнить с нормальной кровью:
- курящего человека со стажем;
- регулировщика уличного движения.
Список использованных источников и литературы:
1. и Ушакова -медицинская экспертиза, 1979.
2. Долин по технике безопасности. - М.: Энергоатом-издат, 1984.
3. , Жерин указания по выполнению лабораторной работы «Основы радиационной безопасности и промышленной экологии: Исследование концентраций вредных газов и паров в воздухе, рабочих помещениях» – Томск, 2004.
4. , Собчук указания о количественном определении карбоксигемоглобина и карбоксимиоглобина Львов, 1974.
5. Под ред. и Окись углерода (угарный газ) // Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков, инженеров и врачей / - 7-е изд. - Л.: Химия, 1977.
6. Лурье по аналитической химии, пер. с нем., М., 1975.
7. , , Торопов труда в химической промышленности.- М.: Химия, 1989.
8. , , Гернет методы определения вредных веществ в воздухе. М.: Госхимиздат, 1962.
9. етоды аналитической химии. Количественный анализ неорганических соединений, пер. с франц., МЛ, 1966.
Приложение 1
, где
D – оптическая плотность раствора. К примеру D=4 означает, что свет был ослаблен в 104=10 000 раз, то есть для человека это полностью чёрный объект; D=1 означает, что свет был ослаблен в 101=10 раз, а D=0 означает, что свет прошёл (отразился) полностью.
Приложение 2
Согласно кривых спектрофотометра Dнач - Dmax образца составила
0,32 – 0,62;0,34 – 0,60 и 0,36 – 0,54.
№ | Раствор | 1 пик, нм/ доли ед.(%) | 2 пик, нм/ доли ед.(%) | Плотность раствора | |
1 | А | раствор исследуемой крови | 539/ 0,602 | 569/ 0,612 | |
2 | Б | раствор крови, содержащей смесь HbCO и Hb (восстановленный дитионитом) | 540/ 0,622 | 568/0,548 | |
3 | В | раствор крови, в которой все формы гемоглобина (Hb, HbO2 и MtHb) полностью переведены в HbCO | 540/ 0,622 | 574 /0,605 | Наибольшая оптическая плотность раствора крови, вследствие наличия только HbCO при определенных длинах волн |
0,602 |
