Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто
- 30% recurring commission
- Выплаты в USDT
- Вывод каждую неделю
- Комиссия до 5 лет за каждого referral
Основным способом получения суспензионных культур является культивирование рыхлого недифференцированного каллуса в жидкой среде на качалке. При этом каллус легко распадается на отдельные клетки и клеточные агрегаты. Рыхлый оводненный каллус выращивают специально для этих целей на среде с 2.4-Д и с уменьшенным содержанием или даже с исключением цитокининов. Хороший эффект на дезагрегацию каллуса оказывает также исключение из питательной среды Са поскольку вследствие этого меньше образуется пектината кальция — основного связывающего материала растительных клеток. Пектинат кальция можно удалить, воздействуя на каллус пектиназой.
Часть каллусной ткани в жидкой среде при ее перемешивании распадается на клетки и небольшие клеточные агрегаты, образуя первичную суспензию. Для избавления от крупных плотных остатков каллуса, от больших клеточных агрегатов ее фильтруют через 1—2 слоя марли, нейлон либо отбирают одиночные клетки и мелкие агрегаты путем осаждения крупных агрегатов при отстаивании суспензии в течение нескольких минут. Кроме того, долю одиночных клеток и мелких агрегатов увеличивают частые пересевы легких фракций суспензии. На степень диссоциации клеток оказывает влияние также состав питательной среды, способы аэрации и перемешивания суспензии. Несмотря на все усилия, суспензия никогда не бывает однородной, состоящей только из одиночных клеток. В лучшем случае последние составляют 50—60%, остальное приходится на долю групп из 2—10 клеток и многоклеточные агрегаты. В очень крупных агрегатах наружные и внутренние слои клеток оказываются в неравноценных условиях питания и аэрации.
С целью получения высокодиспергированной суспензионной культуры чаще всего пытаются контролировать состав питательной среды. Имеются сведения, что ауксины оказывают положительное влияние на процессы диссоциации клеток, а цитокинины, напротив, тормозят их. Следовательно, условия, благоприятствующие растяжению клеток и тормозящие их деление, способствуют максимальной диссоциации суспензионных клеток.
Природа углеводов в питательной среде, оказывая влияние на межклеточные контакты через изменение поверхностных полисахаридов, также может играть определенную роль. Так, введение в питательную среду галактозы, рафинозы или сахарозы приводило к формированию очень больших клеточных агрегатов в суспензии клеток розы. Выращивание клеток с добавлением целлюлолитических ферментов (мацерозим, пектиназа, цел-люлаза) в сочетании с осмотиком увеличивало дисперсию суспензии.
Как бы ни заманчива была перспектива получения в суспензии популяции, состоящей исключительно из отдельных клеток, с точки зрения биологии растительной клетки такая задача представляется малореальной. Для этого необходимо, чтобы после образования срединной пластинки дочерние клетки расходились до начала их следующего деления. Хорошей считается суспензия, состоящая из морфологически выравненных клеток, имеющих небольшие размеры и агрегированных в мелкую группы, включающие не более 10 клеток. Оптимальная плотность клеток в суспензии, обеспечивающая хороший рост, составляет 105— 106 на 1 мл среды.
Суспензионные культуры пересевают чаще, чем каллусные, из которых они были получены. Инокулюм — это часть суспензионной культуры, используемая для пересадки на свежую среду. Инокулюм отбирают стерильными пипетками, шприцами или просто переливают определенную часть суспензии. Последний способ является единственно приемлемым для культур, содержащих крупные агрегаты клеток. В Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина разработан способ получения активно пролиферирующей суспензионной культуры пшеницы, обогащенной способными к соматическому эмбриогенезу клетками. Способ основан на двух методических приемах: отбор вводимой в жидкую среду каллусной культуры и подбор условий глубинного культивирования, предпочтительных для деления выбранного типа клеток (меристемоидные клетки из морфогенных участков каллуса). Этот подход оказался приемлемым для широкого ряда генотипов пшеницы и других зерновых злаков, в частности для кукурузы. И что очень важно, именно из клеток таких суспензионных культур пшеницы и кукурузы впоследствии были выделены протопласты, способные к делению и регенерации растений.
Способы выращивания суспензионной культуры
Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькими способами. Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование. Клетки растут в постоянном объеме питательной среды на установках канального или роллерного типа. Такая система закрыта для всего, кроме газов и летучих продуктов метаболизма. Оказывается, при этом в колбах накапливается значительное количество С02. После замедления роста суспензия разводится до начальной плотности, и цикл выращивания повторяется. Цикл выращивания — это период от помещения инокулюма в свежую среду до следующего субкультивирования. Для накопительных культур чаще всего используются конические широкогорлые колбы разных размеров на платформенных качалках кругового или полукругового типа со скоростью вращения 60—120 оборотов в минуту. Клетки растений, несмотря на ряд специфических особенностей, подчиняются тем же законам роста, что и микроорганизмы, поэтому для их выращивания применяют технологию и аппаратуру, принятую в работе с микроорганизмами. Микроорганизмы обычно культивируют в особых аппаратах, называемых ферментерами. Накопительные культуры можно выращивать в лабораторных ферментерах рабочим объемом 0,5—10 л. По сравнению с глубинным выращиванием в колбах на качалке при культивировании клеток в ферментерах появляются принципиально новые возможности, связанные с их конструкцией.
На культуру клеток в ферментерах можно в любой момент воздействовать различными факторами (температура, свет, газовый режим, физиологически активные вещества, рН и др.) и отбирать пробы клеток для определения динамики роста и метаболизма популяции в цикле выращивания. То есть, не нарушая режима асептики, можно контролировать рост и продуктивность биомассы, изучать влияние на эти процессы различных воздействий. Вместе с тем культивирование растительных клеток в ферментерах сопряжено с трудностями, вытекающими из специфических особенностей клеток высших растений. Наличие вакуоли и целлюлозно-пектиновой оболочки, придающей клеткам не только прочность, но и хрупкость, обуславливает их подверженность механическому стрессу при перемешивании и аэрации. Опасность механического стресса усиливается на стадии растяжения клеток.
Культивирование клеток в жидкой среде осуществляется несколькими способами. Наиболее простым и распространенным является накопительное или периодическое культивирование. Клетки растут в постоянном объеме питательной среды на установках канального или роллерного типа. Такая система закрыта для всего, кроме газов и летучих продуктов метаболизма. Оказывается, при этом в колбах накапливается значительное количество С02. После замедления роста суспензия разводится до начальной плотности, и цикл выращивания повторяется. Цикл выращивания — это период от помещения инокулюма в свежую среду до следующего субкультивирования. Для накопительных культур чаще всего используются конические широкогорлые колбы разных размеров на платформенных качалках кругового или полукругового типа со скоростью вращения 60—120 оборотов в минуту. Клетки растений, несмотря на ряд специфических особенностей, подчиняются тем же законам роста, что и микроорганизмы, поэтому для их выращивания применяют технологию и аппаратуру, принятую в работе с микроорганизмами. Микроорганизмы обычно культивируют в особых аппаратах, называемых ферментерами. Накопительные культуры можно выращивать в лабораторных ферментерах рабочим объемом 0,5—10 л. По сравнению с глубинным выращиванием в колбах на качалке при культивировании клеток в ферментерах появляются принципиально новые возможности, связанные с их конструкцией.
На культуру клеток в ферментерах можно в любой момент воздействовать различными факторами (температура, свет, газовый режим, физиологически активные вещества, рН и др.) и отбирать пробы клеток для определения динамики роста и метаболизма популяции в цикле выращивания. То есть, не нарушая режима асептики, можно контролировать рост и продуктивность биомассы, изучать влияние на эти процессы различных воздействий. Вместе с тем культивирование растительных клеток в ферментерах сопряжено с трудностями, вытекающими из специфических особенностей клеток высших растений. Наличие вакуоли и целлюлозно-пектиновой оболочки, придающей клеткам не только прочность, но и хрупкость, обуславливает их подверженность механическому стрессу при перемешивании и аэрации. Опасность механического стресса усиливается на стадии растяжения клеток.
Ферментеры различных конструкций обеспечивают перемешивание и аэрацию по-разному: вращаясь вокруг собственной оси, будучи в наклонном состоянии, перемешиванием магнитными и механическими мешалками, продуванием сжатого стерильного воздуха через суспензию. Конструкция лопастей мешалок бывает разной, и вращаются они с различной скоростью
Высокая скорость перемешивания ведет к разрушению клеток, снижение интенсивности перемешивания может привести к оседанию части клеток и их гибели. Рост биомассы, которого так стараются добиться в работе ученые, ведет к возрастанию вязкости, что также осложняет культивирование. В отличие от микроорганизмов растительные клетки слипаются между собой и с поверхностями культиватора. Кроме того, они могут скапливаться в верхней части сосуда, образуя пену. Перечисленные особенности растительных клеток заставляют исследователей очень тщательно подходить к выбору типа культиваторов и режиму перемешивания в зависимости от целей и задач экспериментов с суспензионной культурой.
Способ, при котором клетки выращиваются в проточном режиме, называется непрерывным культивированием. В основу создания проточных систем легли опыты, в которых было обнаружено, что добавление в суспензию в фазу экспоненциального роста культуры порций свежей питательной среды позволяет долго поддерживать деление клеток. Непрерывное культивирование может осуществляться в закрытой проточной, полупроточной и открытой проточной системах.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 |
Основные порталы (построено редакторами)