Раннее определение стельности коров методом иммуноферментного анализа прогестерона в сухих пятнах молока на пористых мембранах

Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто

30% recurring commission
Выплаты в USDT
Вывод каждую неделю
Комиссия до 5 лет за каждого referral

Раннее определение стельности коров методом иммуноферментного анализа прогестерона в сухих пятнах молока на пористых мембранах.

Early pregnancy diagnosis in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay for progesterone in dried milk spot samplings on porous membranes.

А. П.Осипов, Ж. В.Самсонова, С. Э.Кондаков / A.P.Osipov, J.V.Samsonova, S.E.Kondakov

; Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Immunoved Ltd.; Faculty of Chemistry, M. V.Lomonosov Moscow State University

Email: *****@***ru

Ранняя диагностика стельности коров чрезвычайно важна для современного молочного животноводства, так как позволяет значительно сократить сервис-период, что приносит молочным хозяйствам существенный экономический эффект. Известны различные методы определения стельности, в том числе ректальный, УЗИ-диагностика, гормональный (по концентрации прогестерона, эстрон-сульфата, хорионического гонадотропина или других ассоциированных с беременностью белков) и др., каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки [1-6]. В России наиболее распространенным до сих пор остается ректальное исследование, позволяющее не только диагностировать беременность, но и получить информацию о функциональных нарушениях при бесплодии. Однако метод является достаточно трудоемким, требует соблюдения определенных санитарных правил, наличия опытного ветеринара и, кроме того, позволяет получить точный диагноз не ранее, чем через 2-3 месяца после осеменения.

Среди существующих методов диагностики стельности наиболее быстрыми по срокам определения являются гормональные иммунохимические методы, основанные на измерении концентрации стероидного гормона прогестерона в молоке или сыворотке крови коров. Уровень прогестерона в коровьем молоке изменяется циклично [7]. В момент овуляции (или эструса) в начале полового цикла содержание прогестерона находится на уровне менее 2 нг/мл, а затем постепенно возрастает до максимума (около 10-20 нг/мл) на 13-15 сутки. Если стельность не наступает, то на 19-21 день после последней течки уровень прогестерона быстро снижается, что указывает на начало следующего цикла созревания яйцеклетки. Если животное становится стельным, то высокая концентрация гормона сохраняется. Таким образом, на 19-21 день цикла концентрация прогестерона у стельной и нестельной коровы существенно различаются. Вывод о статусе коровы проводят на основании полученных значений содержания прогестерона в молоке. При концентрации прогестерона менее 4 нг/мл корова считается нестельной, 4-7 нг/мл – сомнительной, более 7 нг/мл – стельной.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Наиболее часто, при наличии специализированной лаборатории и соответствующего специального оборудования, используют твердофазный иммуноферментный метод анализа (ИФА) прогестерона в образцах молока, отобранных на 19-21-й день после осеменения. Несмотря на то, что данный метод известен давно и широко распространен во многих зарубежных странах, в России он стал использоваться сравнительно недавно и только в некоторых регионах [4]. Основными причинами, тормозящими широкое применение ИФА-метода, являются недостаточное количество лабораторий, оснащенных специальным оборудованием на местах, отсутствие недорогих высококачественных отечественных иммуноферментных наборов реагентов, а также проблема хранения и транспортировки в замороженном виде отобранных в хозяйстве проб молока в диагностические лаборатории, часто находящиеся на значительном расстоянии от самой фермы.

В последние годы в США и странах Евросоюза в медицинской и ветеринарной диагностике активно развивается новая технология получения проб крови или сыворотки, основанная на использовании высушенных на специальной пористой бумаге биологических жидкостей для доставки биообразцов в специализированную лабораторию и последующего проведения анализа. В основе метода лежит уже широко используемая при проведении неонатального скрининга технология сухих пятен крови (Dried Blood Spots, DBS) [8] . Ее преимуществами перед обычными способами получения биообразцов является значительное уменьшение объема отбираемого материала, снижение травмируемости пациентов при заборе малых количеств крови, меньший объем, занимаемый при хранении образцов, возможность пересылки образцов (в том числе по почте) в нормальных условиях без соблюдения требований «холодовой цепи», высокая стабильность при хранении при нормальных температурах. Для решения проблемы транспортировки образцов молока в лабораторию для определения стельности нами впервые в мировой практике предложено использовать подход, аналогичный описанной выше технологии DBS, который основан на получении высушенных пятен молока на пористых мембранных носителях (по аналогии его можно назвать Dried Milk Spots, DMS) и последующем проведении анализа в лаборатории путем десорбции образцов.

В настоящей работе получены экспериментальные данные по измерению прогестерона в процессе полового цикла в молоке коров подмосковного молочного хозяйства Никулино» методом ИФА с использованием разработанного нами твердофазного набора реагентов для определения прогестерона в молоке коров. Проведено раннее определение стельности осемененных коров и сравнение полученных результатов с данными ректального исследования.

Для ранней диагностики стельности использовали пробы цельного молока, отобранные на 21-й день после осеменения у коров голштино-фризской породы. Одну аликвоту (100-200 мкл) свежих образцов молока наносили на мембранный носитель специальной карточки для получения сухих образцов (СПК-3, «) и высушивали на воздухе в течение 2-х часов, а другую аликвоту замораживали при температуре -20оС и в последующем пробы транспортировали в лабораторию, где анализировали методом ИФА. Использовали разработанную нами тест-систему твердофазного ИФА, состоящую из набора жидких полностью готовых к использованию реагентов и полистирольного 96-луночного планшета. Принцип анализа основан на конкуренции определяемого и меченого пероксидазой хрена прогестерона за ограниченное число центров связывания специфических антител, адсорбированных в лунках планшета. Количество образовавшихся пероксидазных иммунокомплексов выявляли с помощью однокомпонентного субстратного раствора на основе тетраметилбензидина (ТМБ). Интенсивность окраски образующегося продукта окисления ТМБ, регистрируемая на спектрофотометре, обратно пропорциональна концентрации прогестерона в анализируемом образце. В качестве стандартов использовали растворы, содержащие известную концентрацию прогестерона. Метод может быть использован для анализа жидких, замороженных и сухих проб молока. Для выявления стельности в качестве стандартного метода и контроля на 65-75 день после осеменения исследуемых животных проверяли ректальным методом.

Результаты исследований с описанием определяемых диагностических параметров теста приведены в таблице 1.

Таблица 1

Определение стельности коров с использованием метода иммуноферментного анализа и ректального исследования*

	ИФА исследование	Всего
Нестельные	Стельные
Ректальное исследование	Нестельные	A = 29 Правильные	B = 14 Ложно-положительные	A+B=43
Стельные	C = 0 Ложно-отрицательные	D = 58 Правильные	C+D=58
Всего	A+C = 29	B+D = 72	A+B+C+D=101

* Чувствительность D/(C+D) = 100%

Специфичность A/(A+B) = 67%

Прогностическая ценность положительного результата D/(B+D) = 80%

Прогностическая ценность отрицательного результата A/(A+C) = 100%

Диагностическая точность (A+D)/(A+B+C+D) = 86%

29% от общего числа образцов (29 проб) с использованием метода ИФА были диагностированы как принадлежащие нестельным животным, что в последующем было подтверждено в результате ректального исследования. Как принадлежащие стельным животным с последующим подтверждением ректальным методом были диагностированы более половины промеренных образцов, т. е. 58 пробы (57% от общего числа животных). Для части образцов (14% от общего числа исследованных проб, всего 14 проб) были получены несовпадающие результаты. В то время как методом ИФА была выявлена высокая концентрация прогестерона в молоке данных животных на 21-й день после осеменения и, соответственно, они первоначально были диагностированы как принадлежащие стельным коровам, ректальное исследование, проведенное позже, не подтвердило наличие стельности. Причиной наличия ложноположительных результатов явилась имевшая место эмбриональная смертность, наступившая в период с момента отбора пробы молока (21-й день после осеменения) до проведения ректального исследования (65-75-й день после осеменения), а также киста яичника, подтвержденная позже для трех животных.

Для сравнительной характеристики используемого ИФА-метода со стандартным эталонным ректальным исследованием были определены такие характерные диагностические параметры, как чувствительность метода, специфичность, диагностическая точность и прогностическая ценность метода. Поскольку тест не выявил ложноотрицательных результатов, чувствительность данного метода составила 100%. При этом было получено 14 ложноположительных результатов из общего количества промеренных проб, что в итоге дает уровень специфичности теста 67%. Прогностическая ценность положительного результата составила величину 80%, отрицательного результата – 100%. Диагностическая точность теста (доля правильно определенных положительных и отрицательных тестов) была равна 86%. Поскольку в данных расчетах учтены все несовпадающие данные, часть из которых, возможно, в конечном итоге нельзя отнести к истинно ложноположительным результатам, то реальные специфичность и диагностическая точность данного метода будут, несомненно, выше. Наиболее важным результатом, свидетельствующим о возможности использования данного метода именно для определения стельности, является высокая чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата. Именно 100%-ное раннее выявление нестельных осемененных коров в первую очередь позволяет сократить сервис-период и получить хозяйству значительный экономический эффект.

Для преодоления сложностей, связанных с транспортировкой образцов молока в специализированную лабораторию, нами впервые предложен метод отбора, хранения и проведения ИФА образцов молока в сухих пятнах на пористых носителях (DMS). В анализе использовали образцы, полученные путем десорбции содержимого пятна молока с пористого материала определенного размера. Показано, что результаты ИФА-определения прогестерона для двух типов исследованных образцов (замороженные жидкие и сухие) хорошо коррелируют между собой (рис.1). При этом образцы молока стельных коров, выявленных на 21-й день после осеменения методом ИФА и подтвержденных впоследствии ректальным исследованием, также были определены как принадлежащие стельным животным и при анализе высушенных образцов. Такие же совпадающие результаты были получены и для нестельных животных. Была также изучена термостабильность образцов молока, высушенных на мембране, как при комнатной, так и при повышенной температуре (37оС). Показано, что образцы молока, хранящиеся в сухом виде на пористых носителях, сохраняют стабильность в течение не менее, чем одного года.

Нанесение проб молока на пористые носители с последующим высушиванием позволяет решить проблему хранения скоропортящихся образцов свежего цельного молока и транспортировки проб в специализированную лабораторию. При использовании такого подхода образец молока может быть отобран, нанесен на носитель и высушен непосредственно на ферме, а в последующем отправлен в диагностическую лабораторию по почте простым письмом. Результат анализа может быть передан по интернету, телефону или другим доступным способом связи. Такое решение проблемы транспортировки образцов и получения результатов исследования позволяет поднять диагностическую службу на новый качественный уровень, значительно увеличивая ее доступность, в том числе для частных хозяйств, находящихся в отдаленных сельских районах, осуществить значительную экономию материальных затрат.

Литература

1. M. Lucy, J. Green, S. Poock. Pregnancy Determination in Cattle: a Review of Available Alternatives. In: Proceedings, Applied Reproductive Strategies in Beef Cattle, August 31 – September 1, 2011; Joplin, MO, 367-376.

2. M. Sheldon. Pregnancy Diagnosis in Cattle. In Practice. 2002. 24. 310-317.

3. Е. Н.Сковородин, Н. А.Игуменова. Методы ранней диагностики стельности. Известия Оренбургского Государственного Аграрного университета. 2011. 2(30-1). 89-91.

4. Н. Шевелев, Н. Матрешина, В. Краснов. Метод ИФА в диагностике бесплодия. Животноводство России. 2008. (1). 47-48.

5. И. И.Богданов, М. А.Богданова, А. Н.Фомин. Иммунологический экспресс-тест на беременность и бесплодие коров. Вестник ветеринарии. 2011. 59(4). 11-12.

6. G. A.Posthuma-Trumpie, A. van Amerongen, J. Korf, W. J.H. van Berkel. Perspectives for on Site Monitoring of Progesterone. Trends in Biotechnology. 2009. 27(11). 652-660.

7. S. F.Larson, W. R.Butler, W. B.Currie. Reduced Fertility Associated with Low Progesterone Postbreeding and Increased Milk Urea Nitrogen in Lactating Cows. Journal of Dairy Sciences. 1997. 80 (7). 1288-1295.

8. T. W.McDade, S. Williams, J. J.Snodgrass. What a Drop Can Do: Dried Blood Spots as a Minimally Invasive Method for Integrating Biomarkers into Population-based Research. Demography. 2007. 44(4). 899-925.