Приложение
к Методологии анализа и качественной
оценки молока и молочных продуктов
Обезжиренное сухое молоко: количественное определение фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина
Метод: ВЭЖХ с обращенной фазой.
1. Данный метод описывает процедуру количественного определения фосфатидилсерина (PS) и фосфатидилэтаноламина (PE) в обезжиренном сухом молоке и подходит для обнаружения твердых веществ пахты в обезжиренном сухом молоке.
2. Содержание PS + PE представляет массовую долю вещества, определенную при помощи метода, описанного в настоящем приложении. Результат выражается в миллиграммах дипалмитоила фосфатидилэтаноламина (PEDP) на 100 г порошка.
3. Экстракция аминофосфолипидов из восстановленного сухого молока при помощи метанола. Определения PS и PE в качестве производного о-фтальдиальдегида (OPA) путем ВЭЖХ с обращенной фазой (RP) и путем флуоресцентной детекции. Квантификация содержания PS и PE в анализируемой пробе при помощи эталонной пробы с известным содержанием PEDP.
4. Все реактивы используются для анализа в чистом виде. Необходимо использовать дистиллированную воду или воду, как минимум, с такой же степенью чистоты, если не предусмотрено иное.
1) Эталонный материал: PEDP, со степенью чистоты не менее 99 %
Эталонный материал хранится при температуре 18 °C.
2) Реактивы для приготовления эталонных и испытываемых проб
а) метанол, по качеству пригодный для ВЭЖХ;
b) хлороформ, по качеству пригодный для ВЭЖХ;
c) моногидрохлорид триптамина;
3) Реактивы для получения производных продуктов о-фтальдиальдегида;
a) гидроксид натрия, водный раствор 12 M;
b) борная кислота, водный раствор 0,4 M, отрегулированный при помощи гидроксида натрия до уровня pH 10,0;
c) 2-меркаптоэтанол;
d) o-фтальдиальдегид (OPA);
4) растворы для вымывания ВЭЖХ;
a) растворы для вымывания приготавливаются использованием реактивов, по качеству пригодных для ВЭЖХ;
b) вода, пригодная по качеству для ВЭЖХ;
c) метанол для флуоресцентного измерения чистоты;
d) тетрагидрофуран;
e) дигидрогенфосфат натрия;
f) ацетат натрия;
g) уксусная кислота.
5. Лабораторное оборудование:
1) аналитические весы с точностью измерения 1 мг, деление 0,1 мг ;
2) химические стаканы емкостью 25 и 100 мл;
3) пипетки емкостью 1 и 10 мл;
4) магнитная мешалка;
5) мерные пипетки емкостью 0,2, 0,5 и 5 мл;
6) мерные колбы емкостью 10, 50 и 100 мл;
7) шприцы емкостью 20 и 10 мкл;
8) ультразвуковая ванна;
9) центрифуга с центробежной силой 27 000 х г;
10) стеклянные бутылочки емкостью примерно 5 мл;
11) мерный цилиндр емкостью 25 мл;
12) измерительный аппарат рН с точностью до 0,1 единицы рН;
13) оборудование для ВЭЖХ;
a) градиентный насос, мощность накачки 1,0 мл/мин при 200 бар;
b) автоматический пробоотборник с функцией дериватизации;
c) обогрев колонки для регулирования температуры колонки на 30°C ± 1°C;
d) флуоресцентный измерительный прибор, диапазон измерения 330 нм, диапазон эмиссии 440 нм;
e) интегратор или программное обеспечение для обработки данных, для измерения площадей пиков;
f) лихросфер – 100 колонка (250 × 4,6 мм) или аналогичная колонка, заполненная октадецилсиланом с величиной частиц 5 мкм.
Отбор проб осуществляется в соответствии со стандартом SM SR EN ISO 707.
6. Процедура количественного определения фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина в обезжиренном сухом молоке осуществляется следующим образом:
1) Приготовление внутреннего эталонного раствора
a) в мерной колбе емкостью 100 мл взвешиваются 30,0 ± 0,1 мг моногидрохлорида триптамина, после чего колба заполняется до максимальной отметки метанолом;
b) 1 мл полученного раствора отбирается пипеткой и помещается в мерную колбу емкостью 10 мл, после чего колба заполняется метанолом до максимальной отметки, для того чтобы получить концентрацию триптамина 0,15 мМ.
2) Приготовление пробы для анализа
a) в химическом стакане емкостью 25 мл взвешивается 1,000 ± 0,001 г пробы обезжиренного сухого молока. При помощи пипетки добавляются 10 мл дистиллированной воды, нагретой до температуры 40 °C ± 1°C. Все содержимое перемешивается в течение 30 минут, для того чтобы растворились возможные комочки;
b) после этого, в мерную колбу емкостью 10 мл при помощи пипетки помещаются 0,2 мл восстановленного молока и при помощи шприца 10 мкл раствора триптамина с концентрацией 0,15 мМ, после чего колба до максимальной отметки заполняется метанолом. Раствор тщательно перемешивается путем опрокидывания колбы и обрабатывается ультразвуком в течение 15 минут;
c) после этого раствор центрифугируется в течение 10 минут в центрифуге при 27000 гхг, и жидкая фракция отбирается в стеклянную бутылочку.
Раствор для испытания хранится при температуре 4°C до проведения ВЭЖХ.
3) Приготовления постороннего эталонного раствора
a) в мерной колбе емкостью 50 мл взвешиваются 55,4 г PEDP, затем при помощи мерного цилиндра добавляются 25 мл хлороформа. Закрытая наглухо колба нагревается до температуры 50°C ± 1°C. Все содержимое тщательно перемешивается до тех пор, пока PEDP не растворится. После этого колба охлаждается до температуры 20°C и дополняется до максимальной отметки метанолом. Все содержимое перемешивается путем опрокидывания колбы;
b) при помощи пипетки 1 мл данного раствора помещается в мерную колбу емкостью 100 мл, после чего колба до максимальной отметки дополняется метанолом. При помощи пипетки 1 мл полученного раствора помещается в мерную колбу емкостью 10 мл, смешивается с 100 мкл раствора триптамина с концентрацией 0,15 мМ (подпункт 1) настоящего пункта), после чего колба дополняется метанолом до максимальной отметки. Раствор перемешивается путем опрокидывания колбы.
Эталонный раствор хранится при температуре 4°C до проведения анализа ВЭЖХ.
4) Приготовление реактива для дериватизации
25,0 ± 0,1 мг ОРА помещаются в мерную колбу емкостью 10 мл, перемешиваются с 0,5 мл метанола и тщательно перемешиваются до полного растворения ОРА. После этого колба заполняется до максимальной отметки раствором борной кислоты. При помощи шприца добавляются 20 мкл 2-меркаптоэтанола.
Реактив для дериватизации может храниться в течение 1 недели при температуре 4°C, оставаясь при этом стабильным.
5) Определение путем ВЭЖХ
a) Растворители для вымывания
Растворитель A: Дигидрогенфосфат натрия с концентрацией 0,3 мМ и раствор ацетата натрия с концентрацией 3 мМ (отрегулированный при помощи уксусной кислоты до уровня pH 6,5 ± 0,1): метанол: тетрагидрофуран = 558:440:2 (v/v/v).
Растворитель B: метанол.
b) Рекомендуемый градиент для вымывания:
Время (мин) | Растворитель A (%) | Растворитель B (%) | Протекание (мл/мин) |
Изначально | 40 | 60 | 0 |
0,1 | 40 | 60 | 0,1 |
5,0 | 40 | 60 | 0,1 |
6,0 | 40 | 60 | 1,0 |
6,5 | 40 | 60 | 1,0 |
9,0 | 36 | 64 | 1,0 |
10,0 | 20 | 80 | 1,0 |
11,5 | 16 | 84 | 1,0 |
12,0 | 16 | 84 | 1,0 |
16,0 | 10 | 90 | 1,0 |
19,0 | 0 | 100 | 1,0 |
20,0 | 0 | 100 | 1,0 |
21,0 | 40 | 60 | 1,0 |
29,0 | 40 | 60 | 1,0 |
30,0 | 40 | 60 | 0 |
При определенных обстоятельствах может понадобиться незначительное изменение градиента вымывания, с тем чтобы получить разрешение, показанное на рисунке 1.
Температура колонки: 30 °C.
c) Впрыскиваемый объем: 50 мкл реактива для дериватизации и 50 мкл испытываемого раствора
d) Уравновешивание колонки
Если колонка каждый день запускается заново, ее необходимо промывать в течение 15 минут растворителем В (100%), а затем в соотношении A:B = 40:60, после чего колонка приводится в равновесие при скорости протекания 1 мл/мин в течение 15 минут. После этого колонка работает вхолостую при впрыскивании метанола.
Прежде чем закрыть колонку на длительное хранение, ее необходимо промыть в течение 30 минут смесью из метанола и хлороформа в соотношении 80:20 (в/в).
e) Определение содержания PS + PE в анализируемой пробе.
f) Хроматографические анализы проводятся в соответствующей последовательности, при этом интервалы между прохождениями должны оставаться константными для того, чтобы получить константное время удержания. Посторонний эталонный раствор впрыскивается через каждые 5-10 анализируемых растворов для того, чтобы можно было оценить калибровочный коэффициент.
Примерно через 20-25 прохождений колонку следует промыть в течение 30 минут при помощи 100 % раствора В (литера а) настоящего подпункта).
6) Режим интеграции
a) Пик PEDP
PEDP вымывается в качестве отдельного пика. Площадь пика определяется при помощи интеграции от углубления до углубления.
b) Пик триптамина
Триптамин вымывается в качестве отдельного пика (рисунок 1). Площадь пика определяется при помощи интеграции от углубления до углубления.
c) Группы пиков PS и PE
В описанных выше условиях (рисунок 1) PS выдает два частично разделенных основных пика, которым предшествует один меньший пик. PE выдает три частично разделенных пика. Общая площадь соответствующего пучка пиков определяется путем проведения основной линии, как это показано на рисунке 1.
Рисунок 1. Результат ВЭЖХ для производных продуктов ОРА фосфатидилсирина (PS) и фосфатидилэтаноламина (PE) в экстракте метанола из восстановленного обезжиренного сухого молока
7. Содержание PS и PE в анализируемой пробе рассчитывается по следующей формуле:
C = 55,36 × [(A2)/(A1)] × [(T1)/(T2)],
где:
C – содержание PS или PE (мг/г порошка) в анализируемой пробе;
A1 – площадь пика PEDP в эталонном растворе (подпункт 3) пункта 7);
A2 – площадь пика PS или PE в испытываемом растворе (подпункт 2) пункта 7);
T1 – площадь пика триптамина в эталонном растворе (подпункт 3) пункта 7);
T2 – площадь пика триптамина в испытываемом растворе (подпункт 2) пункта 7).
8. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:
1) Повторяемость
Относительное отклонение повторяемости выражает изменчивость результатов, полученных одним и те же аналитиком при использовании одинаковых приборов в одинаковых условиях с одной и той же пробой за короткий временной интервал, независимо друг от друга. При этом не должна быть превышена относительная величина в 2%. В случае проведения двух определений в данных условиях, относительная разница между обоими результатами не должна превышать 6% среднего арифметического результатов.
2) Воспроиводимость
В случае проведения двух определений аналитиками в различных лабораториях при использовании различных приборов в разных условиях с разными испытываемыми пробами, относительная разница между обоими результатами не должна превышать 11% среднего арифметического результатов.
Основные порталы (построено редакторами)