МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МОДЕЛИ СВЯЗЫВАНИ БЛОКАТОРОВ С КАЛИЕВЫМИ КАНАЛАМИ
Н., Н., К., В.
ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет имени М. К.Аммосова»,
г. Якутск, Россия. Лаборатория молекулярной динамики, *****@***ru
Разработаны молекулярные модели связывания калиевых каналов с тетраэтиламмонием и аджитоксином в растворах с различной ионной силой.
Ключевые слова – молекулярная динамика, молекулярное моделирование, ионные каналы, блокаторы.
Введение
Ионные каналы – порообразующие белки, поддерживающие разность потенциалов, которая существует между внешней и внутренней сторонами клеточной мембраны всех живых клеток. Трансмембранный транспорт ионов через каналы лежит в основе генерации электрической активности в нервных и мышечных клетках, контроля возбудимости сердечной мышцы, внутриклеточной передачи сигнала, секреции многих гормонов, клеточной плоферации и регуляции клеточного объема. Дисфункция каналов приводит к ряду патологий, начиная с нарушения координации движений и сердечной недостаточности и заканчивая сахарным диабетом. Актуальность изучения их структуры и функционирования обусловлена необходимостью понимания причин возникновения данных патологий и дальнейшей разработки нового типа лекарств, нацеленных на канал, как на мишень. Изучению работы ионных каналов уделяется большое внимание в современной молекулярной биофизике. Среди всего арсенала методов особое место занимает молекулярное моделирование. В отличие от молекулярно-биологических и электрофизиологических методов молекулярное моделирование позволяет получить данные о динамике процессов атомистического уровня.
Молекулярные модели пространственных структур комплексов каналов с блокаторами
Проводились численные эксперименты для исследования механизма открытия канала. Использовалась начальная структура канала в закрытом состоянии. Для определения структуры интерьера канала в открытом состоянии использовались данные работ [1-3]
Полученные структуры подвергались релаксации в течение 1000 пс со следующим МД - протоколом:
· Потенциальное поле OPLS-AA
· Длина траектории 1000 пс, температура термостата 300 К.
· Термостат: Стохастическая динамика.
· Параметр термостатирования 0,02пс (соответствует вязкости воды).
· Диэлектрическая проницаемость среды ε = 1.
· Радиус обрезания для электростатических взаимодействий Rel = 2нм.
· Радиус обрезания для взаимодействий Ван-дер-Ваальса RVdW = 2нм.
· Периодические граничные условия.
· Алгоритм численного интегрирования – Верле.
· Начальное распределение скоростей атомов –распределение Максвелла.
· Шаг интегрирования 0,1 фс.
· Шаг записи в траекторный файл 0,1 пс.
В течение первых 100 пс релаксации для стабилизации структуры канала фиксировались Сα атомы аминокислотных остатков 1-50 и 57-99 в каждой субъединице. Вычислительные эксперименты по проводимости ионов и взаимодействию канала с ингибиторами проводились с трансмембранной частью канала (аминокислотные остатки 24-120 каждой субъединицы).
Изучался динамический механизм блокады канала KcsA молекулой тетраэтиламмония (ТЕА). Было проведено уточнение параметров силового поля. Эффективные заряды на атомах ТЕА определялись с помощью пакета программ GAMESS. Использовался ограниченный метод Хартри–Фока с разложением молекулярных орбиталей по базису 6-31 ГФ**. Эффективные заряды на атомах находились методом Малликена.
С целью оценки вклада электростатических взаимодействий между молекулой тетраэтиламмония и аминокислотными остатками поверхности канала, были сконструированы и отрелаксированы 2 мутанта белка KcsA: KcsA-82Thr и KcsA-82Val, в которых остаток тирозина в 82 положении был замещен на остаток треонина и остаток валина соответственно.
Расчетная ячейка, содержащая канал, заполнялась водой и молекула ТЕА помещалась над внешней поверхностью белка на расстоянии 5Ả от центральной поры канала.
Вычислительный эксперимент осуществлялся в два этапа. На первом этапе с помощью методов управляемой молекулярной динамики, в течение 500пс к атому азота молекулы тетраэтиламмония прикладывалось ускорение 1нм/пс2 направленное вдоль оси канала. На втором этапе ускорение отключалось и расчет проводился с помощью равновесной молекулярной динамики в течении 1500пс. Протокол равновесной молекулярной динамики приведен ниже:
· Потенциальное поле OPLS-AA.
· температура термостата 300 К.
· Термостат: Стохастическая динамика.
· Параметр диссипации 0,02пс (соответствует вязкости воды).
· Диэлектрическая проницаемость среды ε = 2.
· Модель воды TIP3P
· Радиус обрезания для электростатических взаимодействий Rel = 2нм.
· Радиус обрезания для взаимодействий Ван-дер-Ваальса RVdW = 2нм.
· Алгоритм численного интегрирования – Верле.
· Метод определения начальных скоростей атомов – с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла.
· Шаг интегрирования 1 фс.
Для стабилизации структуры белка фиксировались Сα атомы 1-32 и 65-96 аминокислотных остатков каждой субъединицы.
Для создания молекулярно-динамической модели комплекса канала с блокатором на примере аджитоксина использовалось открытое состояние структуры калиевого канала Kv1.2, полученное методом рентгеноструктурного анализа (pdb код 2a79).
Комплекс канал-токсин помещали в липидный бислой, состоящий из 288 молекул пальмитоилфосфатидилхолина, предварительно удалив те молекулы липидов, с которыми могло образоваться перекрывание. Далее оставшийся объем расчетной ячейки заполняли молекулами воды и ионами. Таким образом, в расчетной ячейке объемом 9,62 х 9,62 х10,0 нм3 находился 1 комплекс канала с токсином, около 210 молекул липидов, порядка 13 500 молекул воды и достаточное число ионов натрия и хлора, необходимых как для компенсации заряда белка, так и для создания ионной силы раствора. Общее число атомов в ячейке составляло около 55 000.
Расчеты молекулярной динамики выполнялись с использованием программного пакета GROMACS 4.0 в тяжелоатомном силовом поле ffG43a2 [4]. Применяли прямоугольную периодическую ячейку при постоянном давлении и модель воды SPC. Расчет электростатических взаимодействий выполняли по методу PME с радиусом обрезания 12 Å. Радиус обрезания ван-дер-ваальсовых взаимодействий составлял 20 Å. Для поддержания длины связей использовали алгоритм LINCS. В качестве алгоритма поддержания температуры был выбран термостат Берендсена. Шаг интегрирования составлял 2 фс. Задание начальных скоростей проводили согласно распределению Максвелла при температуре 5К, после чего повышали температуру до 300К в течение 50 пс при наложении ограничений на атомы белков и липидов. После нагревания выполняли релаксацию липидов при сохраняющихся ограничениях на атомы белка в течение 50 пс. Затем проводились расчеты динамических траекторий длиной 5 нс. Расчет энергетических термов и других характеристик систем проводили встроенными функциями программы GROMACS. Для визуализации молекулярных структур и расчета электростатического потенциала использовали программу VMD. Расчет парциальных зарядов на атомах был выполнен с помощью веб-интерфейса к программе PDB2PQR.
Далее, методом молекулярной динамики рассмотрены взаимодействия аджитоксина с AgTx2 с ионными каналами, помещенными в модельный липидный бислой, состоящий из молекул пальмитоилфосфатидилхолина (ПОФХ, POPC). Для моделирования различной ионной силы раствора было выполнено несколько вычислительных экспериментов, при которых в расчетную ячейку добавляли различное количество ионов натрия и хлора, как описано в методах. Было рассмотрено поведение комплексов канал-токсин при практически нулевой концентрации ионов, при физиологической концентрации (0.28% в мольном отношении), а также при концентрациях меньших и больших физиологической.
Выводы
Проведенное исследование структуры и динамики тетрамерных потенциал-зависимых калиевых каналов прокариот и эукариот и их комплексов с блокаторами (токсинами) показывает перспективность использования молекулярного моделирования для поиска новых кандидатов на препараты, блокирующих проведение нервного импульса. Используя методы предсказания структуры по гомологии с хорошо изученными бактериальными каналами, современные силовые поля и методы молекулярной динамики можно с достаточной степенью вероятности получать информацию о строении сайтов связывания лигандов и, при дальнейшем развитии методов, об энергетических характеристиках сродства белок-лиганд. Обращает внимание консервативность поведения энергии связывания блокаторов при вариации ионной силы в 2-3 раза в окрестности физиологических значений. Это указывает на высокую эффективность действия блокаторов при вариации физиологического состояния организма.
Литература
1. Liu Yi-Shiuan, Pornthep Sompornpisut and Eduardo Perozo. Structure of the KcsA channel intracellular gate in the open state. nature structural biology • volume (8) 2001 883-887
2. Liu Y, Holmgren M, Jurman ME, Yellen G. Gated access to the pore of a voltage-dependent K+ channelNeuron. 1997 Jul;19(1):175-84
3. Liu, Y., Jurman, M. E. & Yellen, G. Dynamic rearrangement of the outer mouth of a K+ channel during gating. Neuron 16, 859–867 (1996).
4. Hess B., Kutzner C., Van Der Spoel D., Lindahl E. // J. Chem. Theory Comput. 2008. V. 4(3). P. 435–447.
Binding of blockers with potassium channels: molecular models
Nikolaev I. N., Novoselsky V. N., Shaitan A. K., Shaitan K. V.
Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Professional Education “North-Eastern Federal University named after M. K. Ammosov”, Yakutsk, Russia. Laboratory of Molecular Dynamics, *****@***ru
Molecular models of binding of potassium channels with tetraethylammonium and ajitoxin in solutions of different ionic strength has been developed.
Key - words: molecular dynamics, molecular modeling, ion channels, blockers
Основные порталы (построено редакторами)