9.4. Иммобилизация лекарственных препаратов
В области использования радиационной полимеризации для иммобилизации лекарственных веществ наибольшие успехи достигнуты при иммобилизации противоопухолевых составов в полимерные матрицы. В качестве противоопухолевых веществ используются адриамицин, митомицин-С и 5-фторурацил. В ряде случаев лечение иммобилизованными противоопухолевыми препаратами сочетается с гормонотерапией. Иммобилизованные противоопухолевые вещества, как правило, используются в виде полимерных таблеток или игл, которые вводятся в опухоль. Применение иммобилизованных противоопухолевых препаратов имеет следующие преимущества по сравнению с их введением в виде инъекций или орально: небольшая концентрация лекарственных препаратов в крови, лекарство распределяется непосредственно в небольшой области от введенного препарата. При этом имеет место некроз раковых клеток в пределах 0.5-1 см2 около образца, а диффузия противоопухолевых препаратов прекращается в некрозном слое. Это сводит к минимуму побочные эффекты от применения лекарств. Длительность использования иммобилизованных противоопухолевых препаратов — несколько месяцев. При этом скорость выделения лекарств не изменяется. Такие препараты прошли широкие испытания во многих клиниках Японии.
Для иммобилизации противоопухолевых препаратов обычно используют различные сополимеры и композиции полиэтиленгликоль-метакрилатов с различными полимерами (полистирол, поливинилформаль, полиэтиленгликоль, полиметилметакрилат, полиэтиленоксид). Подчеркивается, что облучение необходимо проводить в бескислородной среде, а доза не должна превышать 10 кГр, в противном случае активность противоопухолевых препаратов существенно снижается
Скорость выделения лекарств регулируют введением в полимерную матрицу порообразующего агента или адсорбента (например, активированного угля).
Технология использования иммобилизованных противоопухолевых препаратов может быть улучшена за счет варьирования гидрофильно-гидрофобных свойств полимерной матрицы, а также использования биодеградируемых полимеров (полипептиды или полилактиды).
В Пастеровском институте (Париж) в рамках программы Международ-ного агенства по атомной энергии (МАГАТЭ) проведены исследования с иммобилизованными моноклональными антителами. Иммобилизация последних осуществлена путем низкотемпературной полимеризации 2-гидроксиэтил-метакрилата. Чувствительность реакций иммобилизованного антитела с антигеном зависит от выбора мономера и его концентрации для создания пористой среды. Важной проблемой является минимизация неспецифических реакций полимерного носителя с антигеном. Для этого необходимо увеличивать гидрофобность полимерной матрицы. Иммобилизованные препараты обычно изготавливаются в виде микросфер или микрокапсул. Для иммобилизации антител используются также микросферы, получаемые полимеризацией акролеина или его сополимеры с 2-гидроксиэтилметакрилатом или метакриловой кислотой.
Преимуществом радиационной полимеризации для иммобилизации антител является достаточно высокая чистота получаемого продукта. Эти препараты можно использовать для иммунологического анализа.
Проведены исследования по иммобилизации антагониста кальция в предварительно полимеризованный гель поли (2-гидроксиэтилметакрилата). Путем радиационного сшивания геля и добавок метилметакрилата и N-винилпирролидона можно широко варьировать скорость выделения лекарства.
Исследована иммобилизация гидрокортизона в гели, полученные радиационной полимеризацией акриловой кислоты. Скорость выделения регулируется дозой облучения и обработкой гелей ацетатом цинка.
9.5. Иммобилизация компонентов крови
Одной из актуальнейших проблем в настоящее время является создание искусственных кровезаменителей, которые могли бы длительное время храниться при обычных условиях не требуя сложной и дорогой аппаратуры. Одним из наиболее перспективных направлений является иммобилизация различных компонентов крови в полимерные композиции с использованием прежде всего радиационных методов полимеризации.
Так гемоглобин был иммобилизован в полимерную матрицу из поли(2-гидроксиэтилметакрилата) с использованием радиационной низкотемпера-турной полимеризации. Особое внимание было уделено выбору оптимальных условий иммобилизации для защиты гемоглобина. Гемоглобин удобен для изучения состояния иммобилизованной молекулы в полимерной матрице, так как он имеет характерное оптическое поглощение. Гемоглобин в мембране подвергался обратимой оксигенации, которая имеет почти то же самое значение, что и в нативном гемоглобине. Описан способ получения полу-синтетической крови на основе иммобилизованного карбоксигемоглобина.
В работах для иммобилизации гемоглобина использована радиационная полимеризация фосфолипидов. Фосфолипиды содержали две длинные полимеризуемые октадекадиенильные группы. Искусственные красные кровяные клетки были получены путем капсулирования гемоглобина с использованием радиационной полимеризации бислойных фосфолипидов — липосом. Искусственные кровяные клетки оказались механически стабильными, легко выдерживали замораживание. Кислородный транспорт подобных систем оказался подобен транспорту нативного гемоглобина. Проводились испытания in vivo (мыши), которые указали на биосовместимость таких клеток.
9.6. Получение «умных» полимеров и их использование для иммобилизации биологически активных веществ
За последние годы все возрастающее значение для медицины и биотехнологии приобретают «умные» полимеры. Так называют полимеры, способные реагировать (сжиматься или набухать) на небольшие изменения во внешней среде (температура, рН, электрическое поле и т. д.). «Умные» полимеры с иммобилизованными БАВ используются для выделения лекарств при определенных условиях, как правило, при заданной температуре или рН. Обычно «умные» полимеры получают традиционными методами, однако в последнее время, для этой цели стала использоваться также радиационная полимеризация. Среди «умных» полимеров наибольшее число публикаций посвящено поли(N-изопропилакриламиду) (поли-N-ИПАА). Данный полимер имеет в воде нижнюю критическую температуру растворения (НКТР) ~32°С, т. е. близкую к температуре человеческого тела. Выше 32°С происходит фазовое разделение, обусловленное конформационным переходом макромолекулы поли-N-ИПАА из рыхлой глобулы в компактный клубок, что сопровождается резким уменьшением размеров макромолекулы.
Было изучено поведение гидрогелей, полученных на основе поли(N-изопропилакриламида) и скорость диффузии иммобилизованных в них лекарственных препаратов в условиях имитирующих человеческий организм. Было установлено, что при 370С и рН=1,4 (нормальные условия в желудке человека) происходит медленное выделение иммобилизованных в гидрогель индометацина и амилазы, но при изменении величины рН до 7,4 (условия в кишечнике) выделение лекарств значительно ускоряется. Таким образом, можно создавать лекарственные формы, позволяющие доставлять препарат к пораженному органу без значительных потерь.
Другим направлением использования таких “умных” полимеров является создание сигнал-чувствительных систем, состоящих из биосенсора, активатора и резервуара для коррекции нарушений в работе различных органов в организме человека. Так для больных диабетом разрабатываются специальные системы с биосенсором на глюкозу, которые запускаются по принципу включение - выключение для выделения определенных порций инсулина, иммобилизованного в гелях, т. е. работающие по принципу поджелудочной железы.
10. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Тема: Инженерная энзимология
Цель занятия: Повторение и закрепление раздела посвященного применению в производстве, экологии и медицине чистых и иммобилизованных ферментных препаратов и клеток, а так же методам их получения и технологическом оформлении процессов на их основе.
План занятия
1. Установка преподавателя о порядке проведения занятия.
2. Сдача студентами теоретической части лабораторной работы.
3. Самостоятельная работа студентов (лабораторная работа №1 и №2).
4. Оформление отчета по выполненной лабораторной работе.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ N-АЦЕТИЛАЛАНИНА: ПРИМЕР ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНОГО ПРОЦЕССА
Цель работы: ознакомление с методами ферментативного разделения оптических изомеров аминокислот, овладение лабораторными навыками проведения таких процессов, определение выхода целевого продукта.
Теоретическая часть: Биологические процессы катализируются ферментами. Многие ферменты обладают высокой каталитической селективностью и могут селективно катализировать реакции только с одним из энантиомеров в рацемате. В современной химии ферменты используются во многих процессах in vitro, особенно в синтезе оптически чистых продуктов. В данном эксперименте изучается гидролиз N-ацетилаланина в присутствии фермента ацилазы I.
За ходом реакции можно следить, если в реакционную смесь добавить нингидрин, который взаимодействует с образующимся аланином, давая яркое пурпурное окрашивание раствора:
Ход работы:
Растворите рацемат N-ацетилаланина (262 мг; 2,0 ммоль) в 10 мл воды. Медленно, при осторожном перемешивании прибавляйте раствор моногидрата гидроксида лития (84 мг; 2,0 ммоль) в воде (4 мл) до тех пор, пока рН раствора не станет равным 7. Контролируйте рН лакмусовой бумагой. В течение 2 минут, при интенсивном перемешивании прибавьте раствор ацилазы I (10 мг) в воде (водный раствор ацилазы I готовится следующим образом: навеска фермента добавляется к 5 мл воды, затем раствор отфильтровывается на стеклянном фильтре, покрытом диатомитом). После этого доведите объем раствора водой до 20,0 мл (точно). Поместите реакционную смесь в водяную баню (37°С) на 60 минут. Затем перенесите ровно 0,25 мл (для этого используйте шприц или мерную пипетку) реакционной смеси в пробирку и добавьте туда нингидрин (Sigma N 1632) (1,25 мл). Эту смесь нагревайте в кипящей воде в течение 20 минут, при этом появится интенсивная пурпурная окраска. После охлаждения аккуратно добавьте содержимое пробирки к буферному раствору, состоящему из 4 М литий-ацетатного водного буфера (рН = 5,2) и диметилсульфоксида в соотношении 1:3, находящемуся в мерной колбе на 250 мл. Доведите объем раствора до 250 мл. Измерьте оптическую плотность на спектрофотометре при λ = 592 нм. В качестве стандарта используйте раствор нингидрина в том же литий-ацетатном бу-
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 |
Основные порталы (построено редакторами)