Синтез фрагмента пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) и структура приготовленных из него фибрилл

УДК 577.32

Синтез фрагмента пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) и структура приготовленных из него фибрилл

1Кафедра физики молекулярных систем. Физический институт. Казанский (Приволжский) федеральный университет. Ул. Кремлевская, 18. г. Казань, 420008. Республика Татарстан. Россия.

Тел.: +7(843)231-51-89. E-mail: andrey. *****@***ru

2Interface Chemistry. Luleå University of Technology. Regnbagsallen, 14, 97187 Luleå, Sweden.

Tel.: +46920491839. E-mail: Oleg. *****@***se

_______________________________________________

*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку

Ключевые слова: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), синтез, фибриллярные агрегаты, зародыши агрегации, атомно-силовая микроскопия (АСМ)

Аннотация

Описана технология приготовления фибриллярных агрегатов из синтезированных фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286). С использованием атомно-силовой микроскопии изучены структурные особенности этих агрегатов, которые представляют собой неупорядоченную сетку из прямых однородных по толщине (~15 нм) фибрилл различной длины от 100 нм до 1 мкм. На некоторых фибриллах видны почкообразные образования сферической формы. Тенденции к образованию из фибрилл агрегатов более высокой степени организации не наблюдалось.

Введение

Пептид Prostatic Acid Phosphatase (РАР) в изобилии присутствует в семенной жидкости человека. Известно, что он способствует оплодотворению. Фрагмент РАР, РАР(248-286), образует фибриллы, известные как SEVI (Semen-driven Enhancer of Virus Infection), присутствие которых в 2-5 раз повышает риск заражения вирусом иммунодефицита человека (HIV). Полагают, что РАР(248-286) образует амилоид, который усиливает взаимодействие между вирионом и клеточной мембраной. В данной работе мы синтезировали пептид РАР(248-286), приготовили фибриллы из этого пептида и исследовали их с помощью метода атомной силовой микроскопии. Описаны особенности фибрилл этого пептида.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Экспериментальная часть

Фрагмент РАР, РАР(248-286), имеет в первичной структуре 39 аминокислот в последовательности:

G I H K Q K E K S R L Q G G V L V N E I L N H M K R A T Q I P S Y K K L I M Y.

Синтез производили с использованием автоматического синтезатора пептидов ABI 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) используя аминокислоты защищенные 9-флуоренилметокси-карбонильными группами с контролем процесса через измерение проводимости реакционной смеси [1,2]. Отделение пептида от субстрата и защитных групп производилось в кислой среде на основе трифторуксусной кислоты.

Отделение целевого пептида от сопутствующих продуктов синтеза производили на жидкостном хроматографе Series 200 Perkin Elmer HPLC System (Waltham, MA, USA) в линейном градиенте вода-ацетонитрил. После очистки раствор пептида в смеси вода-ацетонитрил замораживался при температуре жидкого азота и лиофилизовался при давлении ниже 10-3 мм. рт. ст. Полученный порошок пептида хранился в запаянной ампуле при температуре -70оС до использования. Качество конечного продукта контролировали методом масс-спектрометрии MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-Off-Flight) используя прибор Bruker Biflex IV. Этот метод показал, что полученное вещество содержит более 98% целевого пептида.

Результаты и их обсуждение

Известно, что результат фибриллизации пептида зависит от ряда факторов, таких как концентрация пептида, состав буфера, концентрация солей, а также присутствия предагрегатов. Поэтому перед приготовлением раствора для агрегации использовали специальную процедуру для удаления агрегатов. При этом пептид растворялся в растворе трифторэтанола (ТФЭ), выдерживался в нем в течение 30 минут при перемешивании, но без применения ультразвука, так как ультразвуковое воздействие может привести к агрегации [3]. Далее ТФЭ испаряли в потоке газа азота, пептид растворяли в смеси вода-ацетонитрил и повторно лиофилизовали.

Для приготовления фибрилл готовили раствор 10 миллимолярный раствор РАР(248-286) в 50 миллимолярном фосфатном буфере рН=7.4. Буферный раствор пептида выдерживали при комнатной температуре в течение 5 суток для агрегации. Далее 15 мкл раствора наносили на свежеприготовленную поверхность пластинки слюды и оставляли для инкубации на 15 минут в герметичном контейнере с насыщенными парами воды. Затем пластинка слюды извлекалась из контейнера, избыток буфера удалялся, а пластинка промывалась несколько раз для удаления солей и высушивалась на воздухе.

АСМ изображения фибрилл получали, используя атомный силовой микроскоп Nanoscope II (Digital Instruments/Veeco, Santa Barbara, CA). Измерения проводили полуконтактным и контактным методами. Детали получения и обработки изображений описаны в [4,5].

На рисунках 1 и 2 приведены изображения агрегатов РАР(248-286), полученные контрастированием по высоте. Объемное изображение, полученное контрастированием по сигналу ошибки, представлено на рисунке 3. Такое контрастирование позволяет выявить больше деталей, так как оно более чувствительно к чистоте поверхности. Видно, что агрегаты представляют собой фибриллы, которые имеют вид прямых (в отдельных случаях, искривленных у конца) палочек. Они однородные по толщине с примерно одинаковой толщиной равной около 15 нм и различной длины от 100 нм до 1 мкм и немногим более. На рисунке 2а видны сферические агрегаты с диаметром близким к толщине фибрилл. Можно предположить, что эти агрегаты представляют собой «зародыши» фибрилл, которые не получили дальнейшего развития.

Рисунок 1. Изображение фибрилл, приготовленных при агрегации РАР(248-286) в 50 миллимолярном фосфатном буфере при рН=7.4 и комнатной температуре в течение 5 суток. Полуконтактный метод с контрастированием по высоте.

Рисунок 2а. Один из участков рисунка 1 с пятикратным увеличением. Наблюдаются фибриллы и сферические агрегаты. Контактный метод с контрастированием по высоте.

Рисунок 2б. Другой участок рисунка 1 с пятикратным увеличением. Контактный метод с контрастированием по высоте. На фибриллах наблюдаются утолщения («почки»), которые, вероятно, представляют собой сферические агрегаты, присоединившиеся к фибриллам.

Рисунок 3. Объемное изображение фибрилл с «почками». Контактный метод с контрастированием по сигналу ошибки.

На рисунке 2б такие агрегаты не наблюдаются, однако на некоторых фибриллах видны почкообразные образования. Вероятно, что это сферические агрегаты, адсорбировавшиеся на фибриллах.

Внутренняя структура фибрилл на изображениях не видна, также как нет признаков скручивания, которые типичны, например, для амилоидных Aβ фибрилл [5]. Фибриллы разрознены между собой; нет тенденции к образованию из фибрилл агрегатов более высокой степени организации.

Выводы

1. Методом атомно-силовой микроскопии проведен анализ структурных особенностей фибриллярных агрегатов, сформированных из фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286). Установлено, что эти агрегаты представляют собой неупорядоченную сетку из прямых однородных по толщине (~15 нм) фибрилл различной длины от 100 нм до 1 мкм.

2. Обнаружено, что особенностью фибрилл из фрагментов пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) является наличие в их структуре небольших сферических пептидных агрегатов.

Благодарности

Работа поддерживается грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00011-а).

Литература

[1] Merrifield R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963. Vol.85. P. 2149.

[2] Jones J. Amino acid and peptide synthesis. N.-Y.: Oxford University Press. 2002. 92 p.

[3] Filippov A. V., Grobner G., Antzutkin O. N. Aggregation of amyloid Ab(1–40) peptide in perdeuterated 2,2,2-trifluoroethanol caused by ultrasound sonication. Magn. Reson. Chem. 2010. Vol.48.P.427-434.

[4] Almqvist N., Bhatia R., Primbs G., Desai N., Banerjee S., et al. Elasticity and adhesion force mapping reveals real-time clustering of growth factor receptors and associated changes in local cellular rheological properties. Biophys. J. 2004. Vol.86. P.1753-1762.

[5] Norlin N., Hellberg M., Filippov A. V, Sousa A. A., Grobner G., Leapman R. D., Almqvist N., Antzutkin O. N. Aggregation and fibril morphology of the arctic mutation of Alzheimers Abeta peptide by CD, TEM, STEM and in situ AFM. J. Structural Biol. 2012. V.178. P.174-189.

Synthesis of fragments of Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) peptide and structures of fibrils prepared from this peptide

1 Molecular Physics Division. Institute of physics. KFU. Kremlevskaya, 18. Kazan, 420008. Tatarstan Republic. Russia. Tel.: +7 (843) 231-51-89. E-mail: Andrey. *****@***ru.

2Interface Chemistry. Luleå University of Technolog. Regnbagsallen, 14, 97187 Luleå, Sweden.

Tel.: +46920491839. E-mail: Oleg. *****@***se

Keywords: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), synthesis, fibrillar aggregates, aggregation nucleus, atomic-force microscope (AFM).

Abstract

We describe detailed protocol of preparation of fibrillar aggregates of Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) peptide and structural properties of these aggregates studied by atomic-force microscope. We found that PAP aggregates are characterized by filamentous morphology, consisting of fibrils with similar thickness (~ 15 nm in diameter) and various lengths (from 100 nm to 1 µm long). Some fibrils accompanied by spherical aggregates. The tendency of fibrils to assemble in high level aggregate was not observed.

Графический абстракт

В., А., Н. и Синтез фрагмента пептида Prostatic Acid Phosphatase РАР(248-286) и структура приготовленных из него фибрилл.

Ключевые слова: Prostatic Acid Phosphatase (РАР), синтез, фибриллярные агрегаты, зародыши агрегации, атомно-силовая микроскопия (АСМ).

Тип публикации: полная исследовательская публикация.

Регистрационный код: выставляется редакцией

Страницы: ….