Каталогизация микроорганизмов в составе микробиома трупа на разных стадиях разложения.
Е. И. Тихомирова, студ. 2 курса
Научный руководитель - к. б.н., доц. Н. А. Сидорова
Аннотация.Работа направлена на составление каталога микроорганизмов на разных сроках экспозиции трупного материала. В экспериментах использовался биологический материал свиней (кости, ложе, мягкие ткани, ассоциированные с почвой, чистые мягкие ткани, шерсть). Выделение чистых культур проводилось по принципу механического разобщения, которое соответствовало 4 этапам. Каждый этап в свою очередь предназначен для определения таксона микроорганизма по комплексу признаков. В ходе обработки материалов на 30, 136 и 226 день экспозиции в чистую культуру выделено 35 видов микроорганизмов.
Ключевые слова: микробиологическая экспертиза, факторы разложения, микробиом трупа, каталогизация, аммонификаторы, биохимическая активность.
Существует специфика определения срока давности захоронения трупа, которая усугубляется различными факторами окружающей среды, включая температурные условия, степень инсоляции, кислотность, кислородный режим и т. д. Основными факторами, влияющими на разложение трупа, являются насекомые - некрофилы и микроорганизмы. Целью исследования является изучение основных групп микроорганизмов в составе микробиома трупа и разработка каталога микроорганизмов. Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить морфологическое, культуральное, тинкториальное, биохимическое разнообразие микроорганизмов на разных стадиях экспозиции.
2. Изучить сукцессию в составе микробиомов, контролирующих разные стадии разложения.
3. Выявить видовой состав микробиомов трупов животных на разных стадиях разложения.
4. Систематизировать микроорганизмы по таксономическому разнообразию.
5. Выделить виды-индикаторы для идентификации сроков давности захоронения трупов.
6. Разработать каталог микроорганизмов в соответствии с полученными результатами на разных стадиях разложения трупов.
Работа проводилась с помощью следующих методов исследования: бактериологический метод (посев на среду МПБ - для обнаружения протеолитических ферментов по продуктам аммонификации белков - индола, сероводорода и аммиака, Левина - для идентификации энтеробактерий, кровяной агар - для выявления гемотоксичностимикроорганизмов), бактериоскопический метод для идентификации морфотипа и тинкториальных признаков прокариот с последующей цифровой и иммерсионной микроскопией. Выделение чистых культур осуществлялось способом механического разобщения. Определение до вида соответствовало 4 этапам: установление типа, отдела, семейства, рода и вида по комплексу фенотипических признаков. Для составления каталога микроорганизмов, участвующих в последовательной диструкции органики трупного происхождения заложен модельный эксперимент с использованием трупа свиньи на территории Южной части Карелии. Асептично отбирались пробы шерсти, мягких тканей, копыт, костей и ложа трупа через 30, 136 и 226 суток эксперимента. В лабораторию бактериальные культуры доставлялись в транспортных средах и подвергались микробиологическому исследованию в течение 24- 48 часов. Кроме исследования микробиомов трупа, отобранных в естественных условиях, заложен модельный эксперимет, позволяющий в условиях invitro проследить динамику трансформации исходных микробиоценозов. Моделирование проводилось в разных температурных режимах ( при температуре 21˚С, 2 ˚С, -7 ˚С).
По результатам лабораторных экспериментов составлено 3 каталога микробных культур, доминирующих в трупном материале на 30, 136 и 226 день экспозиции. При этом установлено, что на 30 суткиразложенияв трупном материале присутствовали микроорганизмы, соответствующие 4 типам, 12 отделам, 14 семействам, 14 родам, 24 видам. Учитывая сложность идентификации микроорганизмов в составе природных ценозов, к неопределенным видам отнесены 2 представителя рода Staphylococcusи Chromatium. На 136 сутки выделены культуры, соответствующие 5 типам, 9 отделам, 11 семействам, 11 родам и 22 видам, а на 226 сутки - виды, соответствующие 4 типам, 7 отделам, 8 семействам, 9 родам, 11 видам. Общее количество таксонов микроорганизмов отражено в таблице 1.
Таблица 1.
Количественное разнообразие таксонов в составе микробиома трупа
Сутки разложения | Тип | Отдел | Семейство | Род | Вид |
30 | 4 | 12 | 14 | 14 | 24 |
136 | 5 | 9 | 11 | 11 | 22 |
226 | 4 | 7 | 8 | 9 | 11 |
Во всех вариантах экспозиции выделены лидерные культуры, которые представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Лидерные культуры в составе микробиомов трупа на 30, 136, 226 сутки экспозиции
30 сутки | 136 сутки | 226 сутки |
Bacillus mycoideus- 17,7% | Bacillus cereus - 9,8% | Bacillus mesentericus - 11,2% |
Bacillus subtilis- 33% | Klostridium sp. - 8,8% | Bacillus cereus – 18,3% |
Cupriavidusnecator- 17,7% | F. multivorum – 7,2% | Pseudomonas sp.-11,5% |
В составе ассоциаций микроорганизмов обнаруженымикромицеты, дающие характерный рост на среде Сабуро. Для выделения нитчатых грибов использован модифицированный метод с использованием влажной камеры, инкубацией клеток при комнатной температуре в течение 10 суток. Во всех случаях культуральный рост отличался по способности клеток контаминировать среду, секретировать пигменты и давать дочерние колонии.
В ходе исследования биохимических признаков, микроорганизмы в составе микрофлоры трупа оказались активными в отношении геминовых каталаз, протеаз, гидролаз и альфа - гемолизина.
Выводы:
1. Создан специфический каталог микроорганизмов трупа и его ложа, включающий 35 видов, из которых неидентифицированными до вида оказались 2 представителя рода Staphylococcus и Chromatium;
2. Во всех вариантах обнаружены лидерные культуры, представленные родом Bacillus, обладающим специфическим набором протеолитических, гидролитических ферментов и факторов вирулентности;
3. Выделенные микроорганизмы имели специфическийкультуральный рост Roud - типа, что позволяет идентифицировать их как доминантные в агрессивных условиях среды;
4. Моделирование эксперимента на 226 сутки экспозиции при разных температурных условиях позволило восстановить процессы трансформации микробного сообщества трупа в разных температурных и временных интервалах.
Полученные данные положены в основу разрабатываемых методов микробиологических исследований для определения продолжительности постмортального интервала.
Список литературы
1. Шевченко, И. Н. Экспертные критерии установления давности наступления смерти в позднем посмертном периоде / И. Н. Шевченко. Дисс. … канд. мед. наук.- Киев, 2000.-187с.
2. Шевченко, И. Н. Динамика разложения трупа / И. Н. Шевченко, Л. Л. Голубович, А. В. Куртев. Судово-медичнаекспертиза, №5, 2012.- С. 26-29.
3. Определитель бактерий Берджи/ под ред. Дж. Хоулта.- М. «Мир», 1997.
4. Лябзина, С. Н. Видовой состав и структура комплекса членистоногих-некробионтов Южной Карелии / С. Н. Лябзина. Ученые записки Петрозаводского государственного университета, №4 (117), 2011.- С. 10-19.
5. Ермакова, Ю. В. Определение давности наступления смерти в позднем постмортальном периоде методом спиновых зондов с использованием стекловидного тела. Автореферат дис. … канд. Мед. наук.- М.,2012.- 20 с.
Основные порталы (построено редакторами)