Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно
действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http:///readings/
Поступила в редакцию 21апреля 2014 г. УДК 543.257.5.
Новые подходы к анализу лекарственных препаратов
на основе биоаффинных взаимодействий и биосенсоров
© Бабкина1*+ Софья Сауловна и Улахович2 Николай Алексеевич
1 Кафедра общей и аналитической химии им. . Институт инженерной экологии и химического машиностроения. Московский государственный машиностроительный университет (МАМИ). /4. г. Москва, 105066. Россия.
Тел.: (919) 992-77-10. E-mail: *****@***ru
2 Кафедра неорганической химии. Химический институт им. .
Казанский (Приволжский) федеральный университет, . г. Казань, 420008. Республика Татарстан. Россия. Тел.: (917) 276-82-95. E-mail: Nikolay. *****@***ru
_______________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: анализ лекарственных препаратов, биоаффинные методы, ДНК-сенсоры, винкристин, аперометрические сенсоры.
Аннотация
Биоаффинные методы очень перспективны, поскольку используют высокую чувствительность и селективность таких взаимодействий. Проведено изучение взаимодействия иммобилизованной дез-оксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с винкристином – алкалоидом, обладающим противоопухолевой активностью. Разработан биоаффинный метод его определения на основе использования амперомет-рического ДНК-сенсора. Нижняя граница определяемых содержаний винкристина данным методом составила 2.0·10-9 моль/л.
Введение
Новые подходы к анализу лекарственных препаратов основанные на биологическом сродстве (биоаффинности) молекул, то есть биоаффинные методы, очень перспективны, пос-кольку используют высокую чувствительность и селективность таких взаимодействий. В частности, методы анализа на основе ДНК позволяют определить и количественно оценить действие лекарственных препаратов, имеющих сродство к ДНК [1, 2].
Электрохимические биосенсоры на основе ДНК позволяют изучать взаимодействие эффекторов с ДНК и определять их достаточно быстро, без дорогостоящего оборудования, без длительной пробоподготовки, достаточно специфично и селективно, на уровне малых кон-центраций. Изучение взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и их определе-ние является важным аспектом при разработке новых, более эффективных препаратов и но-вых методов их определения, а также при выяснении фармакокинетики препаратов [3-5].
Нами уже разработаны биоаффинные методы для определения противоопухолевых пре-паратов на основе платиновых комплексов и противоопухолевых антибиотиков антрацикли-новой группы [6-9].
Цель данного исследования заключалась в разработке биоаффинного метода анализа противоопухолевого алкалоида индолового ряда на примере винкристина с помощью амперо-метрического биосенсора на основе выбранной формы иммобилизованной ренатурированной ДНК и стационарного ртутно-пленочного электрода и получения количественных характерис-тик взаимодействия винкристина с данной формой ДНК.
Экспериментальная часть
Вольтамперометрические измерения проводились с помощью вольтамперометрической системы SVA-1BM-01 “Аналитик” (Болгария). Рабочим электродом служил стационарный ртутно-пленочный электрод (СРПЭ) с серебряной подложкой (d = 0.5 мм), либо разработанный БС, в котором мембрана с иммобилизованной ренатурированной ДНК (р-ИДНК) закрепляется на поверхности СРПЭ с серебря-ной подложкой [10]. Электрод сравнения – насыщенный каломельный электрод (нас. к.э.). Растворен-ный кислород удаляли из исследуемых растворов током аргона в течение 20 минут, во время регист-рации вольтамперограмм газ пропускали над раствором.
Электронные спектры поглощения были сняты на спектрофотометре U-2000 “Hitachi” (Япония) в кюветах толщиной 1 см. Точность измерения оптической плотности составляла ±1%. Все измерения проводили при термостатировании 298±2 К.
Использовали ДНК эритроцитов цыплят фирмы Reanal: соотношение N/P 1.6-1.7. Растворы ДНК с концентрацией 0.01 мг/мл в физиологическом растворе (0.9% раствор NaCl) готовили по точной навеске. Концентрацию растворов ДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при λ = 258 нм.
Применены следующие химические реагенты и растворы: нитрат целлюлозы (НЦ) ФТ-30 типа коллоксилин марки ч. со средним содержанием азота 11.5-12%; органические растворители высокой чистоты марки х. ч. (ацетон, толуол, гексан) и 25% раствор глутарового альдегида фирмы Reanal; ацетатный буферный раствор рН = 5.2; 1 М раствор NaCl.
Исходный раствор с концентрацией 1,0.10-4 моль/л готовили по точной навеске винкристина (препарата “Онковин” фирмы Lilly France S. A. (Франция)). Исследуемые растворы готовили по точной навеске и методом последовательных разбавлений.
Приготовление биочувствительной части амперометрического р-ИДНК-содержащего биосен-сора. Образцы р-ИДНК получали путем растворения навески НЦ в системе органических раство-рителей при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с последующим добавлением водного раствора ренатурированной ДНК (р-ДНК) (денатурацию проводили кипячением раствора ДНК на водяной бане с последующим медленным охлаждением в течение 5 минут) и раствора глутарового альдегида для химического связывания молекул р-ДНК с НЦ матрицей. После этого на поверхности чашки Петри формировали пленку и высушивали ее в течение 5 минут. Полученные образцы р-ИДНК хранят в холодильнике при t = 2-50 oС. Биочувствительную часть БС, полученную по данной мето-дике, закрепляли на корпусе электрохимического детектора (СРПЭ) с помощью прижимных колец [10].
Методика определения винкристина с помощью амперометрического ДНК-содержащего биосенсора. Для проведения биоаффинного мембранного концентрирования винкристина амперомет-рический БС, содержащий р-ИДНК, погружали в электрохимическую ячейку с модельным раствором винкристина различной известной концентрации при pH 5.2 на 20 мин. Затем раствор сливали, ячейку промывали и заливали в нее 5 мл 1 М NaCl, деаэрировали раcтвор током аргона в течение 20 мин и снимали вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0.2 В до -1.85 В (Е0 = -0.02 В, скорость наложения потенциала 0.5 В/с). Измеряли высоту катодного пика при потенциале -0.9 В и по получен-ным данным строили градуировочный график, который использовали для определения неизвестной концентрации винкристина.
Методика определения константы аффинного связывания (Ксвяз) комплекса винкристин - р-ИДНК. Ксвяз комплекса винкристин – р-ИДНК определялась на основании данных метода вольт-амперометрии. Для этого готовили серию растворов винкристина (рН = 5.2) с различной начальной концентрацией, опускали в каждый из них НЦ мембрану с р-ИДНК площадью 1 см2 на 20 мин. После проведения биоаффинного мембранного концентрирования была проведена реактивация р-ИДНК-содержащей мембраны раствором 1 М NaCl. После удаления мембраны проводили измерение высоты тока пика восстановления винкристина при потенциале -0.9 В. После этого строили градуировочный график зависимости высоты тока пика восстановления винкристина при потенциале -0.9 В от его исходной концентрации. Данную градуировочную зависимость использовали для определения кон-центрации комплекса препарат-р-ИДНК и равновесной концентрации винкристина, которые использо-вали для построения графика Скетчарда в координатах [ОНК-ДНК]/[ОНК] – [ОНК-ДНК] [11].
Результаты и их обсуждение
Препарат винкристин – природный алкалоид индолового ряда – широко применяется в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей (острые лейкозы, лимфогранулематоз и др.). Известно, что винкристин является интеркалятором то есть, имея планарные ароматические кольца, его молекулы встраиваются и колеблются между парами азотистых оснований двойной цепи ДНК раковых клеток, тем самым, ингибируя син-тез нуклеиновых кислот и останавливая рост опухоли [3, 12, 13].
Проведено изучение взаимодействия иммобилизованной дезоксирибонуклеиновой кис-лоты (ДНК) с винкристином – алкалоидом, обладающим противоопухолевой активностью.
В данном исследовании была решена задача оптимизации состава биочувствительной части сенсора, что является основным этапом разработки любого биосенсора. При разработке биоаффинного метода определения винкристина с помощью амперометрического ДНК-сенсо-ра на основе СРПЭ был учтен механизм его действия, как интеркалятора [3], а также его способность связываться с денатурированной однонитевой ДНК за счет электростатического взаимодействия [14]. Поэтому при приготовлении биочувствительной части биосенсора на основе ИДНК после термической денатурации раствора ДНК проводили медленное охлажде-ние. В результате при сохранении одинарных цепей образуются и фрагменты вторичной структуры ДНК за счет восстановления водородных связей либо между двумя цепями, либо внутри одной спирали, то есть происходит процесс частичной ренатурации. В данном случае образуется ренатурированная ДНК, или р-ДНК. Затем проводили ковалентную иммобилиза-цию данной формы биомолекулы в НЦ матрице.
Таким образом, ренатурацию проводили для того, чтобы взаимодействие онкопрепарата с ДНК протекало наиболее эффективно, что возможно при реализации обоих механизмов комплексообразования винкристин-ДНК. Это и делает целесообразным иммобилизовать ДНК одновременно и в одно - и в двунитевой форме. Следует отметить, что ковалентная иммо-билизация позволяет фиксировать обе формы молекулы ДНК на матрице, обеспечивая наи-большую доступность центров связывания ДНК для молекул эффектора.
При разработке биоаффинного метода определения онкопрепарата для исключения неспецифического связывания онковина матрицей-носителем ДНК в процессе концентриро-вания была приготовлена НЦ мембрана без ДНК. Далее были проведены все операции, опи-санные выше в Экспериментальной части, при этом появления аналитического сигнала не наблюдалось. Проведенный холостой опыт с НЦ матрицей без иммобилизованных молекул р-ДНК, подтверждает отсутствие неспецифического связывания молекул винкристина с мат-рицей-носителем, поскольку отсутствовал аналитический сигнал винкристина после концент-рирования на немодифицированной НЦ мембране.
Разработан биоаффинный метод определения противоопухолевого фармпрепарата [15] на основе использования амперометрического ДНК-сенсора.
Табл. 1. Результаты определения винкристина с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС (n = 5, Р = 0.95) | ||
Введено, с·105, моль/л | Найдено, | sr |
0.0001 | 0.00012±0.00002 | 0.08 |
0.005 | 0.0052±0.0003 | 0.03 |
0.01 | 0.013±0.001 | 0.04 |
0.50 | 0.51±0.03 | 0.03 |
1.00 | 1.06±0.05 | 0.02 |
(с ± d)·105, моль/лРезультаты определения вин-кристина в составе препарата “Онко-вин” (фирма Lilly France S.A. (Фран-ция)) с помощью амперометрического р‑ИДНК-содержащего БС представле-ны в табл. 1.
Линейная область определяемых концентраций винкристина с помо-щью амперометрического БС на осно-ве р-ИДНК составляет 1.0·10-5-2.0·10‑9 моль/л. Нижняя граница определяемых содержаний (сн) составляет 2.0·10-9 моль/л (sr = 33%). В случае определения более низких концентраций винкристина объем раствора можно увеличить на этапе концентрирования его на мембране БС. Предложенный метод анализа может использоваться для определения данного эффектора ДНК в многокомпонентных сис-темах, в том числе биологических.
Предложенный биоаффинный метод определения винкристина основан на предвари-тельном концентрировании на модифицированной ДНК нитроцеллюлозной мембране в сос-таве амперометрического биосенсора, реактивации биочувствительной части ДНК-сенсора и дальнейшем восстановлении при потенциале -0.9 В. Для сокращения времени анализа было выбрано оптимальное время концентрирования винкристина на мембране с р-ИДНК по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени концентрирования (мин), которое составило 20 минут. Оптимальное время реактивации мембраны выбиралось по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени реактивации (мин), оно также составило 20 минут. Таким образом, было выбрано оптимальное время концентрирования и реактивации для сокращения времени проведения анализа без возможного ухудшения его чувствиитель-ности.
Методом Скетчарда [11] определена константа аффинного связывания (Ксвяз) комплек-са винкристина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК) с помощью вольт-амперометрических данных. Ксвяз для комплекса винкристин-р-ИДНК составила (5.0±0.4) ·105 л/моль, что свидетельствует о высокой специфичности взаимодействия. Чувствитель-ность разработанного биоаффинного метода отражает высокое сродство винкристина к р-ИДНК, подтвержденное высоким значением константы аффинного связывания образующе-гося комплекса. Следует отметить, что проведенное исследование позволило смоделировать реальную систему цитостатик-ДНК опухолевых клеток организма и еще раз количественно подтвердить высокую эффективность данного противоопухолевого препарата.
Для оценки возможности использования разработанного амперометрического ДНК-сен-сора как нового инструмента биохимического анализа при определении фармпрепаратов была разработана методика определения винкристина в реальных объектах – в сыворотке крови человека.
Табл. 2. Результаты определения винкристина в сыворотке крови с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС (n = 5, Р = 0.95) | ||
Анализируемый объект | Вольтамперометрия с ДНК-сенсором | |
Найдено, (с | sr | |
Сыворотка крови 1 | 2.4±0.3 | 0.06 |
Сыворотка крови 2 | 0.12±0.02 | 0.08 |
Сыворотка крови 3 | 2.1±0.4 | 0.09 |
Сыворотка крови 4 | 0.45±0.03 | 0.03 |
Сыворотка крови 5 | 1.33±0.2 | 0.075 |
±d)·10-8, моль/лПри анализе сыворотки крови на содержание винкристина в элект-рохимическую ячейку вводили 3 мкл сыворотки крови, опускали р-ИДНК-содержащий БС и все дальнейшие операции проводили как описано вы-ше; для нахождения неизвестной концентрации фармпрепарата ис-пользовали градуировочный график. Результаты определения винкрис-тина в сыворотке крови с помощью амперометрического ДНК-сенсора представлены в табл. 2.
Выводы
Разработан биоаффинный метод определения винкристина на основе использования амперометрического ДНК-сенсора.
Литература
[1] S. Cagnin, M. Caraballo, C. Guidicci, P. Martini, M. Ross, M. Santana. Overview of electrochemical DNA biosensors: New approaches to detect the expression of life. Sensors. 2009. Vol.9. P.3122-3148.
[2] S. Rauf, J. J. Gooding, K. Ahtar. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction. J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2005. Vol.37. No.2. P.205-217.
[3] D. Graves, L. Velea. Intercalative binding of small molecules to nucleic acids. Cur. Org. Chem. 2000. Vol.4. No.9. P.915-929.
[4] J. Wang. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics. Biosens. Bioelectron. 2006. Vol.21. No.10. P.1887-1892.
[5] G. Bagni, D. Ozella, R. Sturchio, M. Mascini. Deoxyribonucleic acid (DNA) biosensors for environmental risk assessment and drug studies. Anal. Chim. Acta. 2006. Vol.1016. P.345-353.
[6] , , Климович определение компонентов биоспецифического взаимодействия дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и антител к ней с образованием комплексов Pt(II). Журн. аналит. хим. 1998. Т.53. №6. С.604-607.
[7] , , Климович аутоантител к ДНК с помощью биосенсора на основе комплекса Pt(II) с ДНК. Прикл. биохимия и микробиология. 1998. Т.34. №5. С.572-575.
[8] Babkina S. S., Ulakhovich N. A., Zyavkina Yu. I. Amperometric DNA biosensor for the determination of auto-antibodies using DNA interaction with Pt(II) complex. Analytica Chimica Acta. 2004. Vol.502. No.1. P.23-30.
[9] , , Улахович противоопухолевого антибиотика доксорубицина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК. Фармация. 2006. №.5. С.9-11.
[10] Budnikov H. C., Medyantseva E. P., Babkina S.,S. An enzyme amperometric sensor for toxicant determination. J. Electroanal. Chem. 1991. Vol.310. P.49-55.
[11] Варфоломеев C. Д. Биокинетика. М.: ФАИР-Пресс. 1999. 720с.
[12] L. C. Wong, H. Nhgan, H. Ma. Primary treatment with vincristine, dactinomycin and cyclophosphamide in cell tumor of the ovary. Gynecologic Oncology. 1989. Vol.34. No.2. P.155-158.
[13] P. J. Souquet, P. Fournel. Carboplatin, vinblastin and mytomycin (CMV) in advanced and disseminated non small cell lung cancer. Lung cancer. 1991. Vol.7. No.1. P.102.
[14] P. Bijnen, J. Schellens. Drug interactions in oncology. Oncology. 2004. Vol.5. No.8. P.489-496.
[15] Руководство по медицине. Диагностика и терапия. Под ред. Р. Беркоу, Э. Флетчера. М.: Мир. 1997. С.771-878.
