Соколова Елена
К вопросу о локализации агрегатов гибридного белка PRP-GFP в клетках дрожжей S. CEREVISIAE
Научный руководитель:
Ряд нейродегенеративных болезней млекопитающих (губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, в том числе так называемое «коровье бешенство», «скрепи» овец), а также такие болезни человека, как Куру-куру, болезнь Кройцфельда-Якоба, фатальная семейная бессонница и болезнь Герштмана-Штрауслера-Шейнкера, относятся к группе прионных заболеваний. При развитии всех этих болезней в нервной системе и черепных кровеносных сосудах образуются отложения молекул белка PrP (от prion protein), находящихся в аномальной конформации. Агрегаты PrP токсичны для нейронов и вызывают их гибель и, как следствие, прогрессирующую дегенерацию нервной ткани, что, в конце концов, приводит к смерти организма. Механизм токсического действия агрегатов PrP неясен.
Белок PrP при синтезе в клетках дрожжей формирует агрегаты, сходные по своим биохимическим характеристикам c агрегатами из мозга больных млекопитающих. Гибридный белок, в котором последовательность мышиного белка PrP слита с последовательностью зелёного флуоресцентного белка медуз (GFP), также агрегирует в дрожжах, что можно наблюдать с использованием флуоресцентного микроскопа.
Целью нашей работы была проверка гипотезы о локализации гибридного белка PrP-GFP в ядрах клеток дрожжей S. cerevisiae.
Штамм дрожжей BY4742 был трансформирован плазмидой (нехромосомной молекулой ДНК, которая способна к автономной репликации и может содержать дополнительные гены) PCUP1-PrP-GFP. Трансформанты были отобраны на селективной питательной среде без аминокислоты лейцина. Далее трансформанты выращивались на среде с добавлением сульфата меди для индукции транскрипции с плазмидного промотора CUP1, и затем распределение гибридного белка PrP-GFP было проанализировано под флуоресцентным микроскопом с использованием зелёного светофильтра. Ядро визуализировалось при помощи ДНК-специфического красителя DAPI (синий светофильтр).
Мы показали, что сигналы, полученные с использованием зелёного и синего светофильтров, практически никогда не локализуются в одном и том же месте, что свидетельствует об отсутствии агрегатов PrP-GFP в ядре дрожжевых клеток. Это значит, что в белке PrP отсутствуют характерные для дрожжей сигналы ядерной локазизации, а также о том, что токсичность фибрилл PrP у млекопитающих, по-видимому, не связана с прямым взаимодействием агрегатов с ядерными структурами.
