ТОЛЬКО ДЛЯ IN VITRO ДИАГНОСТИКИ

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения концентрации плазминогена

и уровня антиплазминов

Экспресс-фибринолиз-тест

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор Экспресс-фибринолиз-тест предназначен для оценки состояния фибринолитической системы при диагностике и контроле за лечением тромбозов и ДВС-синдромов по следующим методикам:

1. Определение концентрации плазминогена;

2. Определение уровня антиплазминовой активности.

I. Определение концентрации плазминогена

Принцип. В данном способе[1] субстратом для плазмина служит сгусток фибрина, получаемый в результате добавления к плазме специально приготовленного реагента - растворимого фибрина. Определяют время индуцированного стрептокиназой лизиса фибринового сгустка в разведенной (1:10) плазме, длительность которого зависит от содержания плазминогена. Концентрацию плазминогена, выраженную в % к норме, находят по предварительно построенной калибровочной кривой.

Состав набора.

1. Растворимый фибрин (лиофильно высушенный реагент из плазмы человека) - 4 фл..

2. Буфер трис-НСI (концентриров. 20:1 раствор, 0,2 М), 5,0 мл - 1 фл.

3. Стрептокиназа (лиофильно высушенная), 5000 МЕ - 2 фл.

4. Растворитель для стрептокиназы, 10,5 мл - 1 фл.

5. Контрольная плазма (лиофильно высушенная) - 1 фл.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Все реагенты, входящие в набор, используются только для применения in vitro.

Все компоненты набора в используемых концентрациях не токсичны.

При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые пер­чат­­ки, так как образцы плазмы крови человека следует рассматривать как потенциально инфициро­ванные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепати­та В или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ, РЕАГЕНТЫ

- Термобаня на +37оС;

- центрифуга лабораторная; секундомер;

- пипетки вместимостью 0,1 мл, 1,0 мл, 5,0 мл; пробирки стеклянные;

- цилиндр мерный вместимостью 100 мл;

- вода дистиллированная; перчатки резиновые хирургические.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Кровь для исследования забирают из локтевой вены в пластиковую или силикониро­ван­ную пробирку, содержащую 3,8% раствор натрия лимоннокислого 3-х замещенного (цитрата нат­рия), соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Кровь центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. В результате получают бедную тромбоцитами плазму, которую переносят в другую пробир­ку, где хранят до проведения исследования.

Центрифугирование должно проводиться непосредственно после взятия крови, а отбор плазмы на исследование - сразу же после центрифугирования. Не допускается анализ плазмы, имеющей сгустки, гемолиз и полученной более 2 ч. назад, а также замороженной плазмы крови.

1.1. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ К РАБОТЕ

А. Разведение растворимого фибрина.

В один из флаконов с растворимым фибрином внести 2,0 мл дистил­ли­­ро­ванной воды и раство­рить содержимое при ком­натной температуре и легком покачивании в тече­ние 10 мин. В результате получают разведенный растворимый фибрин, который можно хранить при комнатной температуре не более 4 ч или не более 3 дней при температуре +2...+8оС. Замораживание разведенного растворимого фибрина не допускается.

Б. Разведение буфера.

Содержимое флакона с концентрированным буфером перенести в мер­ный цилиндр и довести объем дистиллированной водой до 100 мл. В результате полу­чают ра­бочий раствор буфера, который хранят в герметично закрытом флаконе при температуре +2...+8оС до 1 мес.

В. Разведение контрольной плазмы и приготовление калибровочных растворов.

Во флакон с контрольной плазмой внести (точно!) 1,0 мл дистил­ли­­ро­ванной воды и раство­рить содержимое при ком­натной температуре и легком покачивании в тече­ние 3 мин. В ре­зуль­та­те получают контрольную плазму с уровнем плазминогена, равным 100%.

Разведенную контрольную плазму хранят при комнатной температуре не более 2 ч. Калиб­ровочные разведения плазмы после их приготовления должны быть использованы в течения 1 ч в условиях хранения при +18...+25оС.

Калибровочные разведения плазмы приготавливают в соответствии с таблицей:

Контрольная плазма + Дист. вода

Разведение

Уровень плазминогена, %

Контрольная плазма

-

100%

0,25 мл + 0,25 мл

1 : 2

50%

0,25 мл + 0,75 мл

1 : 4

25%

Г. Разведение стрептокиназы.

В один из флаконов со стрептокиназой внести (точно!) 5,0 мл растворителя для стрептокизазы и раство­рить содержимое при ком­натной температуре и легком покачивании в тече­ние 2 мин. В ре­зуль­та­те получают готовый к использованию раствор стрептокиназы, который можно хранить при комнатной температуре не более 4 ч или не более 7 дней при температуре +2...+8оС. Допускается замораживание при минус 16-20оС в течение 2 недель.

1.2. ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ

1) В пробирку внести 0,1 мл контрольной плазмы (или ее разведения) и выдержать на водяной бане 1 мин при +37оС.

2) Последовательно добавить 0,1 мл стрептокиназы, 0,8 мл буфера (имеющего температуру +37оС) и 0,1 мл растворимого фибрина. Немедленно включить секундомер и продолжать инкубировать на водяной бане при +37оС. Периодически доставая пробирку из водяной бани (не встря­хивая) и наклоняя ее, отмечают время от момента внесения растворимого фибрина до лизиса образовавшегося в ней сгустка.

Примечания. 1. Все компоненты реакции, кроме буфера и плазмы, должны иметь ком­натную температуру (+18...+25оС);

2. Время от момента добавления к плазме стрептокиназы до внесения растворимого фибрина не должно превышать 15 сек;

3. Критерием визуальной оценки результата служит распад сгустка на отдельные его фрагменты.

Определения рекомендуется проводить не менее 2 раз с каждым из разведений конт­роль­ной плазмы.

По полученным средним данным строят калибровочную кривую (см. рисунок), где по оси ординат отмечают время лизиса (сек), а по оси абсцисс - уровень плазминогена в % от нормы, в соответствии с указанными выше разведениями контрольной плазмы. Калибровочную кривую для данной серии набора строят одно­к­ратно.

Рис. Координатная сетка для определения концентрации плазминогена

1.3. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

1) В пробирку внести 0,1 мл исследуемой плазмы и выдержать на водяной бане 1 мин при +37оС.

2) Последовательно добавить 0,1 мл стрептокиназы, 0,8 мл буфера (имеющего температуру +37оС) и 0,1 мл растворимого фибрина. Немедленно включить секундомер и продолжать инкубировать на водяной бане при +37оС. Периодически доставая пробирку из водяной бани (не встря­хивая) и наклоняя ее, отмечают время от момента внесения растворимого фибрина до лизиса образовавшегося в ней сгустка.

См также Примечания к п. 1.2.

По калибровочной кривой, зная время лизиса (в сек), находят содержание плазминогена (в % от нормы).

1.4. ЧТЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В норме время лизиса фибринового сгустка составляет ориентировочно 45-55 сек. При этом уровень плазминогена (по калибровочной кривой) варьирует от 70 до 120%.

Измеряемый диапазон содержания плазминогена по данному методу охватывает пределы от 20-130%. При концентрации плазминогена ниже 20% лизис сгустка не происходит. Снижение концентрации плазминогена наблюдается у больных с ДВС-синдромом, при тромбофилиях, связанных с дефицитом или аномалией плазминогена, при лечении фибринолитиками.

Результаты методики не зависят от уровня фибриногена в исследуемой плазме (в диапазоне от 0,5 до 8,0 г/л).

2. Определение АНТИПЛАЗМИНОВОЙ АКТИВНОСТИ

Принцип. В данном способе, как и в способе, описанном выше, субстратом для плазмина служит сгусток фибрина, получаемый в результате добавления к плазме специально приготовленного реагента - растворимого фибрина. В двух пробирках определяют время индуцированного стрептокиназой лизиса фибринового сгустка разведенной (1:10) плазмы, которая до внесения в тест-систему растворимого фибрина, не инкубировалась (первая пробирка) и инкубировалась со стрептокиназой в течение 4 мин при +37оС (вторая пробирка). При инкубации плазмы со стрептокиназой плазминоген исследуемого образца плазмы трансформируется в плазмин и ингибируется антиплазминами (главным образом, a2-антиплазми­ном). По соотношению времени лизиса инкубированной и не инкубированной со стрептокиназой плазмы больного, в сравнении с контрольными данными, рассчитывают индекс активности антиплазминов.

2.1. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ К РАБОТЕ

Содержание раздела аналогично пункту 1.1.

В качестве контрольной нормальной плазмы может использоваться контрольная плазма, входящая в состав данного набора, ИАА которой равен 100%, или пул из 5-6 образцов бедной тромбоцитами плазмы здоровых людей. Пулированная плазма после приготовления может быть разлита по 0,3-0,5 мл в пластиковые или стеклянные флаконы (для повторного определения контрольных значений на протяжении срока пользования набором) и заморожена при температуре -12...-20оС на срок до 2 недель.

Замороженные пробы контрольной нормальной плазмы следует размораживать на водяной бане при температуре +37оС в течение 3 мин и использовать в течения 1 ч в условиях хранения при комнатной температуре.

2.2. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

А. Определяют время лизиса фибринового сгустка, как описано в разделе 1.3.

Результат (в сек) обозначают как ЛИСбез инкуб.

Б. Определяют время лизиса фибринового сгустка по следующей методике:

1) В пробирку внести 0,1 мл исследуемой плазмы (или контрольной) и выдержать на водяной бане 1 мин при +37оС.

2) Добавить 0,1 мл стрептокиназы, инкубировать при +37оС в течение 4 мин (точно!).

3) Внести 0,8 мл буфера (имеющего температуру +37оС) и 0,1 мл растворимого фибрина, немедленно включить секундомер и инкубировать на водяной бане при +37оС. Периодически доставая пробирку из водяной бани (не встря­хивая) и наклоняя ее, отмечают время от момента внесения растворимого фибрина до лизиса сгустка.

Результат в сек обозначают как ЛИСс инкуб.

Примечание: 1. Время от момента добавления к плазме буфера до внесения растворимого фибрина не должно превышать 10 сек.

2. Критерием окончания лизиса служит распад сгустка на отдельные его фрагменты.

Нормативы дополнительно устанавливаются в каждой лаборатории.

2.3. ЧТЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Индекс активности антиплазминов (ИАА) рассчитывают по формулам:

Б

ИАА, % =

--------- ´ 100 ;

К

1 1

1 1

Б = -------------------------------------------------- - ---------------------------------------------- ;

К = -------------------------------------------------- - ----------------------------------------------- ,

ЛИС(Б)без инкуб. ЛИС(Б)с инкуб.

ЛИС(К)без инкуб. ЛИС(К)с инкуб.

где: Б - расчетный показатель в плазме больного; К - тот же показатель в контрольной нормальной плазме; ЛИС(Б)без инкуб. – время лизиса плазмы больного без ее инкубации со стрепто­ки­назой; ЛИС(Б)с инкуб. – время лизиса плазмы больного с инкубацией плаз­­мы со стрептокиназой в течение 4 мин; ЛИС(К)без инкуб. – время лизиса контрольной нормальной плазмы без ее ин­кубации со стрептокиназой; ЛИС(К)с инкуб. – время лизиса плазмы больного с инкубацией плаз­мы со стрептокиназой в течение 4 мин.

В норме ЛИС(К)без инкуб. – составляет 45-55 сек (см. пункт 1.4.), а ЛИС(К)с инкуб. – 95-145 сек, в среднем 120 сек. Пределы нормальных колебаний ИАА 70-120%.

Снижение индекса активности антиплазминов наблюдается при активации фибринолиза, в т. ч. при ДВС-синдроме, применении фибринолитиков, а также при тяжелом повреждении клеток печени. Повышение активности антиплазминов может наблюдаться при злокачественных опухолях и некоторых видах патологии беременности (гестозы), воспалительных процессах, атеросклерозе.

Результаты определений не зависят от уровня фибриногена в исследуемой плазме (в диапазоне от 0,5 до 8,0 г/л), но методика не выполнима при концентрации плазминогена в плазме больного ниже 30%.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

Набор рассчитан на выполнение 80 определений при расходе разведенного растворимого фибрина по 0,1 мл на 1 анализ.

Хранение набора должно проводиться при температуре +2...+8оС в течение всего срока год­ности набора (18 мес.). Допускается хранение при температуре до +25оС в течение 10 сут. Замораживание не допускается.

Время использования набора не должно превышать 2 недель с момента вскрытия его ком­по­нентов.

Разведенный растворимый фибрин можно хранить при комнатной температуре не более 4 ч или не более 3 дней при температуре +2...+8оС. Замораживание не допускается.

Рабочий раствор буфера можно хранить в герметично закрытом флаконе при температуре +2...+8оС не более 1 мес.

Разведенную контрольную плазму можно хранить при комнатной температуре не более 2 ч. Калиб­ровочные разведения контрольной плазмы после их приготовления должны быть использованы в течения 1 ч в условиях хранения при комнатной температуре.

Раствор стрептокиназы можно хранить при комнатной температуре (+18...+25оС) не более 4 ч или не более 7 дней при температуре +2...+8оС. Допускается замораживание при минус 16-20оС в течение 2 недель.

[1] Заявка на патент № 000, приоритет от 4.12.2000.