Определение сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке и в смесях, содержащих обезжиренное сухое молоко и, по необходимости, жиры, витамины, минеральные соли, сахарозу, антикоагулянты и/или разжижающие средства и прочие вещества, в частности, антиоксиданты и эмульгаторы

Приложение № 12

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Опрлолоол

АМ

Определение сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке и в смесях,

содержащих обезжиренное сухое молоко и, по необходимости, жиры, витамины, минеральные соли, сахарозу, антикоагулянты и/или разжижающие средства и прочие вещества, в частности, антиоксиданты и эмульгаторы

1.  Под содержанием сухой молочной сыворотки подразумевается согласно данному методу массовая доля казеинмакропептидов в процентах.

2.  Содержание казеинмакропептидов определяется согласно приложению № 11. Пробы с положительным результатом, в целях обнаружения казеинмакропептидов A, подвергаются анализу путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ). В качестве альтернативного решения, пробы подвергаются сразу же анализу ВЭЖХ с обращенной фазой. Оценка результатов проводится путем сравнения с эталонными пробами из обезжиренного сухого молока с содержанием сыворотки и без сыворотки. Считается, что сухая сыворотка была обнаружена, если массовая доля превышает 1% (м/м).

3.  Все реактивы используются для анализа в чистом виде. Следует использовать дистиллированную воду или воду с не меньшей степенью чистоты. Чистота ацетонитрила должна соответствовать требованиям спектроскопии или качества ВЭЖХ.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Реактивы, необходимые для проведения данной процедуры, перечислены в приложении № 11к настоящей Методологии.

Реактивы для ВЭЖХ с обращенной фазой.

1) Раствор трихлоруксусной кислоты

240 г трихлоруксусной кислоты (CCl3COOH) растворяются в воде, после чего раствор дополняется водой до достижения количества 1000 мл. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.

2) Растворитель для вымывания A и B

Растворитель для вымывания A: В мерную колбу емкостью 1000 мл помещаются 150 мл ацетонитрила (CH3CN), 20 мл изопропанола (CH3CHOHCH3) и 1,00 мл трифторуксусной кислоты (TFA, CF3COOH). После чего колба дополняется водой до отметки 1000 мл.

Растворитель B: В мерную колбу емкостью 1000 мл помещаются 550 мл ацетонитрила, 20 мл изопропанола и 1,00 мл трифторуксусной кислоты. После чего колба дополняется водой до отметки 1000 мл. Растворитель фильтруется перед использованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

3) Хранение колонки

После проведения анализов колонка ополаскивается растворителем В (через градиент), а затем ацетонитрилом (30 минут, также через градиент). После этого колонка хранится в ацетонитриле.

4) Эталонные пробы

a)  Сухое молоко, соответствующее требованиям государственного резерва (соответственно, [0]).

b)  То же сухое молоко, фальсифицированное путем добавления 5% (м/м) сухой сыворотки со средним составом (соответственно [5]).

c)  То же сухое молоко, фальсифицированное путем добавления 50% (м/м) сухой сыворотки со средним составом (соответственно [50]).

4.  Оборудование, необходимое для проведения данной процедуры, описано в приложении № 11 к настоящей Методологии.

1)  аналитические весы;

2)  по желанию: центрифуга с силой центрифугирования 2 200 г, оборудованная центрифугальными трубками с заглушкой или колпаком, емкостью приблизительно 50 мл;

3)  механический встряхивающий механизм;

4)  магнитная мешалка;

5)  стеклянная воронка диаметром, примерно, 7 см;

6)  фильтровальная бумага, средняя скорость фильтрования с диаметром примерно 12,5 см;

7)  стеклянный фильтровальный механизм с мембранным фильтром с диаметром пор 0,45 мкм;

8)  мерные пипетки, номинальный объем 10 мл, или система пипетирования, при помощи которой за 2 минуты можно перенести объем в 10,0 мл;

9)  питающая система для отдачи 20,0 мл воды с температурой, примерно, 50°;

10)  водяная баня, регулируемая термостатом на 25 ± 0,5 °C;

11)  оборудование для ВЭЖХ включает в себя:

a)  система насосов для бинарных градиентов;

b)  инжектор, ручной или автоматический, емкостью 100 мкл;

c)  колонка Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (длина 25 см, внутренний диаметр 0,46 см) или колонка с обращенной фазой с такой же величиной пор, на основе силикагеля;

d)  печь с колонкой, регулируемой термостатом на 35 ± 1 °C;

e)  УФ детектор с меняющейся длиной волны для проведения измерений при 210 нм (при необходимости, можно использовать и длины волн до 220 нм) с чувствительностью 0,02 Å;

f)  интегратор, при помощи которого можно провести интеграцию на общей основной линии или от впадины до впадины.

Колонка может использоваться и при комнатной температуре, при условии, что температура колеблется максимально на 1°C. В противном случае, время удержания для CMPA сильно изменяется.

5.  Отбор проб осуществляется в соответствии с процедурой, описанной в стандарте SM SR EN ISO 707.

Проба должна храниться в условиях, гарантирующих ее целостность и неизменность состава.

6.  Процедура определений сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке и в смесях, содержащих обезжиренное сухое молоко и, по необходимости, жиры, витамины, минеральные соли, сахарозу, антикоагулянты и/или разжижающие средства и прочие вещества, в частности антиоксиданты и эмульгаторы, осуществляется следующим образом:

1)  Приготовление пробы для анализа

Сухое молоко помещается в сосуд с герметической пробкой, емкость которого приблизительно в три раза превышает взятый объем сухого молока. Сосуд сразу же герметически закрывается. Сухое молоко основательно перемешивается путем многократного опрокидывания сосуда.

2)  Навеска пробы

Взвешиваются 2,000 ± 0,001 г пробы в центрифугальной трубке или в подходящей закрывающейся емкости (50 мл).

В случае смесей, взвешивается количество пробы для анализа, в котором масса обезжиренной навески пробы составляла бы 2,00 г.

3)  Отделение жира и белка

a)  навеска пробы смешивается с 20,0 мл теплой воды (50 °C). Порошок растворяется путем пятиминутного помешивания механической мешалкой, а в случае кислой пахты – в течение 30 минут. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется при температуре 25°C;

b)  10,0 мл раствора трихлоруксусной кислоты равномерно добавляются при температуре 25°C в течение двух минут, интенсивно перемешиваясь при помощи магнитной мешалки. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется на 60 минут;

c)  в условиях 2 200 г центрифугируются в течение 10 минут, а затем фильтруются через фильтровальную бумагу, при этом первые 5 мл фильтрата следует выбросить.

4)  Хроматографическое определение

a)  проводится анализ ВЭЖХ согласно процедуре, описанной в приложении № 11. В случае получения отрицательного результата, анализируемая проба не содержит сухой сыворотки. В случае получения положительного результата, проводится ВЭЖХ с обращенной фазой, описанной ниже. В качестве альтернативного решения, может сразу же проводиться ВЭЖХ с обращенной фазой. Части кислой сухой пахты могут дать в случае применения метода, описанный в приложении № 1, ложноположительные результаты. В случае ВЭЖХ с обращенной фазой это исключено;

b)  до проведения анализа ВЭЖХ с обращенной фазой необходимо оптимизировать условия градиентов. Время удержания CMPA, равное 26 ± 2 минуты, является оптимальным для систем градиентов с мертвым объемом, примерно, 6 мл (объем, начиная с места, в котором встречаются растворители, до объема петли инжектора включительно). В случае систем градиентов с меньшим мертвым объемом (например, 2 мл) оптимальное время удержания составляет 22 минуты.

Анализу подвергаются растворы эталонных проб, не содержащие сыворотку, а также эталонных проб с 50% содержанием сыворотки.

Впрыскиваются 100 мкл жидкой фракции или фильтрата в аппарат ВЭЖХ, работающий в условиях, описанных в таблице 1.

Таблица 1

Условия градиентов во время анализа для оптимального хроматографического определения

Время (мин)

Проток (мл/мин)

% A

% B

Кривая

Исходное

1,0

90

10

*

27

1,0

60

40

линейная

32

1,0

10

90

линейная

37

1,0

10

90

линейная

42

1,0

90

10

линейная

В процессе сравнения обеих хроматограмм необходимо определить длину пика CMPA.

При помощи следующей формулы можно рассчитать начальный состав растворителя, используемого для нормального градиента %, B = 10 – 2,5 + [13,5 + (RTcmpA – 26) / 6] × 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 1,11,

где:

RTcmpA – время удержания CMPA в тестовом градиенте;

10 - исходный % B тестового градиента;

2,5 - % B на половине времени действия, за вычетом % B при запуске в нормальном градиенте;

13,5 – половина времени действия тестового градиента;

26 – необходимое время удержания для CMPA;

6 – соотношение подъемов тестового градиента и нормального градиента;

30 - % B в начале минус % B по истечении 27 минут в тестовом градиенте;

27 – время действия тестового градиента.

c)  Анализ растворов тестовых проб

Точно 100 мкл жидкой фракции или фильтрата (литера с) подпункта 3) настоящего пункта) впрыскиваются в аппарат ВЭЖХ, в который вводится растворитель для вымывания со скоростью 1,0 мл/минута.

Состав растворителя для вымывания в начале анализа был описан в литере b) подпункта 4) пункта 6 настоящего приложения. Как правило, он соответствует соотношению A:B = 76:24. Сразу же после впрыскивания образуется линейный градиент, который после 27 минут выдает процентное содержание В на 5% и выше. После этого начинается градиент, в котором состав растворителя для вымывания в течение 5 минут настраивается на 90% В. Данный состав остается неизменным в течение 5 минут, после чего в течение следующих 5 минут в виде линейного градиента он понижается до первоначального состава. В зависимости от вместимости насосной системы, следующее впрыскивание может быть проведено через 15 минут после достижения исходных условий.

Время удержания CMPA должно составлять 26 ± 2 минуты. Эта величина может быть получена путем изменения исходных и конечных условий первого градиента. Разница в процентах В в начале и в конце градиента должна составлять в каждом случае 5% В.

Растворители для вымывания должны быть дегазированы и поддерживаться и дальше в этом состоянии. Это очень важно для безупречной работы градиентной насосной системы. Стандартное отклонение времени удержания для пика CMPA должно составлять менее 0,1 минуты (n = 10).

Для каждой пятой пробы впрыскивается эталонная проба и вновь определяется калибровочный фактор R (подпункта 1) пункта 8).

d)  На хроматограмме анализируемой пробы (E) время удержания пика CMPA составляет примерно 26 минут.

Интегратор рассчитывает автоматически высоту H пика CMPA. Длина основной линии проверяется для каждой хроматограммы. В случае неправильного положения основной линии, необходимо провести повторно анализ или интеграцию.

Если пик CMPA достаточно отграничен от остальных пиков, необходимо провести распределение согласно основной линии от впадины до впадины. Вертикали следует отметить на общей основной линии, которая должна начинаться вблизи от пика CMPA. Для эталонного раствора и испытываемых растворов необходимо использовать один и тот же тип интеграции. В случае общей основной линии, необходимо проверить консистенцию отдельных проб и эталонного раствора.

Для количественного определения необходимо в обязательном порядке проверять хроматограммы на беспорядочность, которая может быть вызвана нарушением в работе оборудования, соответственно, колонки, или по причине происхождения или типа анализируемых проб. В случае возникновения сомнений, анализ следует повторить.

5)  Калибровка

a)  эталонные пробы подвергаются процедурам, описанным в подпунктах 2)-4) пункта 6. Необходимо использовать свежие приготовленные растворы, поскольку CMP расщепляется в 8% трихлоруксусной кислоты при комнатной температуре. При температуре 4°C раствор может храниться в течение 24 часов. В случае продолжительных серий испытаний рекомендуется использовать охлажденную чашу в автоматическом пробоотборнике.

Литера b) подпункта 4) пункта 7 может быть опущена, если из предыдущих анализов известно процентное содержание В в начале анализа.

b)  Перед хроматографическим определением проб необходимо впрыснуть 100 мкл эталонной пробы, не содержащей сыворотку [0].

На хроматограмме не должно появиться ни одного пика для времени удержания пика CMPA.

c)  Калибровочный коэффициент определяется после впрыскивания такого же количества фильтрата, как и в случае проб (литера а) настоящего подпункта).

7.  Представление результатов осуществляется следующим образом:

1)  Метод и формула расчета

Расчет калибровочного коэффициента R:

Пик CMPA: R = W/H,

где:

R – калибровочный коэффициент пика CMPA;

H – высота пика CMPA;

W – содержание сыворотки в эталонной пробе.

2)  Расчет содержанния сухой сыворотки в пробе в процентах

W(E) = R × H(E),

где:

W(E) – массовая доля в процентах (м/м) сухой сыворотки в пробе (E);

R – калибровочный коэффициент пика CMPA (подпункт 1);

H(E) – высота пика CMPA пробы (E).

В случае если W(E) больше 1 % и разница между соответствующим временем удержания и временем удержания эталонной пробы составляет меньше 0,2 минуты, в данном случае проба содержит сухую сыворотку.

3)  Точность метода

a)  Повторяемость

Разница между результатами двух исследований, выполненных одновременно или сразу же один за другим, одним и тем же аналитиком, с использованием одних и тех же приборов, на том же анализируемом материале, не должна превышать массовую долю 0,2% м/м.

b)  Воспроизводимость

Не определена.

c)  Линейность

В диапазоне с 0 до 16 % содержания сухой сыворотки должна присутствовать линейность при коэффициенте корреляции > 0,99.