Новые технологии в конструировании эритроцитарных диагностических систем

Новые технологии в конструировании эритроцитарных диагностических систем

Министерство образования и науки Российской Федерации

ГОУ ВПО Иркутский государственный университет

Кафедра физико-химической биологии

, ,

Новые технологии в конструировании эритроцитарных диагностических систем

Иркутск 2011

УДК

ББК

Пособие содержит краткое теоретическое обоснование современных методов конструирования эритроцитарных иммунодиагностикумов с помощью конъюгации и практические примеры конъюгации эритроцитов с бактериальными антигенами с использованием синтетических полимеров.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов и аспирантов биологических специальностей, преподавателей и научных работников.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ	4
I. Конструирование эритроцитарных иммунодиагностикумов с помощью конъюгации (обзор)	5
1. Конъюгирующие компоненты, используемые при конструировании эритроцитарных диагностикумов	5
2. Сенсибилизация эритроцитов белковыми антигенами	8
II. Сенсибилизационная активность карбоксил и азолсодержащих полимеров при конъюгации эритроцитов барана с бактериальными антигенами» (ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ)	14
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ	24

ВВЕДЕНИЕ

Для определения иммунологической реактивности организма к индигенным микроорганизмам необходимо иметь диагностические тест - системы, при выборе которых существенное значение имеет их чувствительность и специфичность, а также и экономический фактор. В ряде случаев применение простых и недорогих методов может быть более эффективным, чем использование дорогостоящей тест - системы с высоким уровнем чувствительности и специфичности. Поэтому разработка технологических подходов к выделению функционально активных антигенов, создание на их основе искусственных антигенов и применение новых конъюгирующих компонентов на основе синтетических полимеров является актуальной при создании и стандартизации недорогих тест- систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью.

I.

Конструирование эритроцитарных иммунодиагностикумов с помощью конъюгации

(Обзор)

Конъюгирующие методы нагрузки эритроцитов использовали K. Landsteiner, J. Sheer еще в 1936г. при соединении стромы эритроцитов с диазовеществами. В результате такие стромы могли агглютинироваться сыворотками против азобелков, приготовленных из тех же диазокомпонентов. Затем с помощью диазосвязи к интактным эритроцитам были присоединены белки. Танизация эритроцитов для присоединения белков была предложена лишь девять лет спустя. Но и после разработки этого приема, получившего широкое распространение, применение конъюгации с целью сенсибилизации эритроцитов белками продолжалась.

1. Конъюгирующие компоненты, используемые при конструировании эритроцитарных диагностикумов

Существует ряд методов присоединения белков к поверхности эритроцитов после предварительной обработки последних. Механизм сенсибилизации эритроцитов белками через азосвязь рассматривается как химическая конъюгация.

Использование танизированных эритроцитов при конструировании тест-систем имеет множество недостатков. Так, многие сыворотки в низких разведениях агглютинируют танизировянные несенсибилизированные эритроциты и эти агглютинирующие факторы не удаляются при истощении сывороток нетанизированными эритроцитами. Истощение же сывороток танизированными эритроцитами проводить нельзя из-за возможного связывания (благодаря гемосенсибилизации) антител или антигенов, подлежащих определению с помощью серологических реакций с эритроцитарными диагностикумами.

В развитии конъюгирующих методов гемосенсибилизации несомненную роль сыграло стремление повысить чувствительность и упростить технологию получения белковых диагностикумов, избежать предварительного этапа обработки эритроцитов. В качестве конъюгирующих компонентов применяют различные вещества: бисдиазобензидин, тетразотированный бензидин, дифлуородинитробензен, толилен-2,4-диизоцианат, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, CrCl3, водорастворимые карбодиимиды, формальдегид, глутаровый альдегид, диаминодифениламин, бромцианин, соли бисдиазорил, риванол, амидол. Действительно, сенсибилизация с помощью CrCl3 и некоторых других веществ технически проще. Однако многие методы конъюгации оказались более сложными, чем нагрузка эритроцитов с предварительной танизацией – либо из-за необходимости синтеза ex tempore конъюгирующего агента (при использовании бензидина), либо из-за предварительной поликонденсации нагруженных белков (при использовании тетраазотированного диаминодифениламина и некоторых других веществ).

В тех случаях, когда иммунные, особенно лиофилизированные, сыворотки определенного видового происхождения не сенсибилизируют или очень слабо сенсибилизируют танизированные эритроциты, методы конъюгации оказывались высокоэффективными. Глутаровый альдегид для нагрузки белками применяют в различных условиях. Активация эритроцитов возможна также, если вместе с глутаровым альдегидом эритроциты обрабатывать толилен-2,4-диизоцианатом. В этом случае эритроциты, очевидно, располагают большим набором активных рецепторных групп.

Методы конъюгации белков с эритроцитами с помощью водорастворимых карбодиимидов, толилендиизоцианата, хлористого цинка, хлористого циана описаны в работах H. Becht, B. Malole. Конъюгирующая активность дифлуородинитробензена и дифтординитродифенилсульфона, как и глутарового альдегида, может проявляться в предварительной активации эритроцитов. Другие методы конъюгации белков с помощью полиэлектролита полиоксидония описаны в работах и др.

Механизм сшивки белков и эритроцитов по химической природе неодинаков для различных конъюгирующих веществ. Иногда различные конъюгирующие агенты взаимодействуют с одинаковыми группами белков. Например, с карбоксильными группами, кроме CrCl3, реагируют также карбодиимиды и риванол. Со стороны конъюгируемых белков в связывании, как показано и (1978), могут участвовать карбоксильные группы (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, С-концевая карбоксильная группа), свободные аминогруппы (лизин и N-концевая аминогруппа), остаток фенола (тирозин), остаток индола (триптофан), остаток имидазола (гистидин), алифатическая оксигруппа (серин и треонин), сульфгидрильная группа (цистеин). В ряде случаев сшивка может, видимо, развиваться одновременно за счет различных групп белка. При всех различиях химического механизма конъюгация во всех подобных случаях обеспечивается ковалентным связыванием*.

_______________________________________

* Ковалентная связь (атомная связь, гомеополярная связь)- связь между двумя атомами за счет обобществления двух электронов – по одному от каждого атома.

2. Сенсибилизация эритроцитов белковыми антигенами

Процесс сенсибилизации эритроцитов белками (антигенами и/или антителами) с помощью различных конъюгирующих химических компонентов при создании эритроцитарных диагностикумов имеет свои особенности.

Нагрузка эритроцитов белковыми антигенами с помощью конъюгирующих компонентов открыла большие возможности получения стабильных эритроцитарных диагностикумов. В первую очередь, очень важно было изучить характер сенсибилизации эритроцитов с помощью наиболее часто используемых конъюгирующих компонентов.

В серии опытов, выполненных рядом исследователей, показана эффективная сенсибилизация эритроцитов барана иммуноглобулинами в присутствии риванола, как конъюгирующего агента. Однако при использовании риванола иногда требовались большие дозы сенситина: от 6,25 до 400,0 ЕС/мл для очищенного препарата столбнячного анатоксина и от 3,12 до 400,0 ЕС/мл – дифтерийного.

Испытывались способы сенсибилизации эритроцитов с помощью других конъюгирующих компонентов: CrCl3 (в концентрациях 0,3, 0,4 и 0,5%); АСИ – ализариновый синий индикатор ( 0,02, 0,08, 0,11 и 0,16%), который впервые был предложен при получении антительных эритроцитарных диагностикумов; риванола ДЧС – диазоль чёрный С (диаминодифениламинтетразотат), 1,5% глютарового альдегида.

При каждом из испытанных способов сенсибилизации чувствительность тест-систем в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) четко, хотя и различным образом, зависела от дозы белка (анатоксина). Самая высокая чувствительность тест-системы при использовании столбнячного анатоксина достигалась при применении 0,5% раствора CrCl3 и 0,02% раствора риванола, а дифтерийного анатоксина – при использовании 0,16% АСИ и риванола.

По данным других авторов, эффективность сенсибилизации зависит от свойств конъюгирующего агента для разных белков по-разному: для сенсибилизации эритроцитов бычьим альбумином, фиксированных глутаровым альдегидом, оптимальным является толилен-2-4-диизоцианат, а для сенсибилизации рибонуклеопротеидом вируса гриппа – дифлуородинитробензен. Чувствительность методов без применения конъюгирующих агентов (с помощью танина и KiO4) в проведенных опытах существенно ниже, то же следует сказать и о нагрузке столбнячным анатоксином с помощью KiO4.

Исследования показали, что по расходу столбнячного анатоксина применяемые способы нагрузки (конъюгаты) располагаются в нисходящем порядке следующим образом: KiO4, риванол, CrCl3 (независимо от его концентрации), танин, ДЧС и АСИ (при 20% концентрации эритроцитов), АСИ ( при 10% концентрации эритроцитов). По расходу дифтерийного анатоксина порядок расположения конюгатов по нисходящей активности другой: риванол, 0,08% АСИ, 0,11% раствор АСИ + танин, глутаровый альдегид и CrCl3 (независимо от его концентрации), KiO4, 0,16% раствора АСИ и ДЧС.

С ростом концентрации АСИ эффективность, сенсибилизации столбнячным анатоксином существенно растет, а дифтерийным достоверно не изменяется. При нагрузке дифтерийным анатоксином с уменьшением концентрации АСИ величина оптимальной дозы сенситина снижается. Снижение в 4 раза концентрации дифтерийного анатоксина при сенсибилизации с помощью глутарового альдегида в 2 раза уменьшает титр РПГА. Можно отметить, что при использовании в качестве конъюгирующих агентов CrCl3, ДЧС и глутарового альдегида чувствительность РПГА зависит от концентрации анатоксина в большей мере, чем при использовании риванола и АСИ. Полученные данные показывают необходимость индивидуального подхода к выбору условий сенсибилизации с помощью различных конъюгирующих агентов.

Опыт многих исследователей свидетельствует о том, что для нагрузки танизированных эритроцитов дифтерийным и столбнячным анатоксинами препараты последних необходимо не только концентрировать, но и очищать от примесей. В то же время применение ДЧС позволяет получать диагностикумы хотя и низкой чувствительности, из нативных препаратов анатоксинов. В этой связи эффективно были использованы другие конъюгирующие агенты, в первую очередь – высокоэффективный риванол. Исследования показали пригодность для сенсибилизации этим методом любых испытанных серий нативных препаратов дифтерийного и столбнячного анатоксинов.

Чувствительность и специфичность в РПГА приготовленных таким образом диагностикумов была не ниже полученных из высокоочищенных препаратов анатоксинов.

Видимо при нагрузке анатоксинами с помощью риванола развивается избирательная сенсибилизация, при которой примеси не играют заметной роли. Однако в некоторых наблюдениях при использовании в качестве конъюгирующего агента бис-диазобензидина примеси ингибировали, а при нагрузке танизированных эритроцитов – не снижали чувствительность РПГА. Очевидно, что вопросы специфичности белковой сенсибилизации и значения примесей в препарате белкового сенситина должны исследоваться с обязательным учетом свойств белка, а также с учетом свойств конъюгирующего компонента.

В опытах проведенных рядом исследователей изучалась эффективность сенсибилизации эритроцитов поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAg).

Сравнивали нагрузку танизированных эритроцитов, сенсибилизацию с помощью CrCl3 и риванола. Наибольшая чувствительность и рентабельность диагностикумов достигнуты при использовании риванола.

При нагрузке с помощью CrCl3 эффективными были дозы 114-228 мкг/мл, но при этом титр РПГА был низким. Сенсибилизация с помощью риванола при дозах 7 мкг/мл и выше обеспечивала высокий титр антител в РПГА, при снижении дозы HBsAg до 3,5 мкг/мл титр антител в РПГА падал. Для сенсибилизации эритроцитов иммуноглобулиновыми препаратами применяют те же коньюгирующие химические агенты, что и для нагрузки белковыми антигенами.

Исследования, проведенные с соавт., показали эффективное применение 1% водного раствора метола в качестве конъюгирующего компонента при сенсибилизации эритроцитов барана с эталонными штаммами вирусов гриппа А / Филиппины / 2 / 82 (113 №2), А / Миссисипи / 1 / 85 (113 №2), А / СССР / 090 / 77 (111 №1), А / Тайвань / 1 / 86 (111 №1), В / Сингапур / 222 / 79, В / Энн Арбор / 1 / 86 и арбовирусов Карши, Тамды, Чим, клещевого энцефалита, лихорадки, Сырдарьи, Тягиня, Синдбис.

Изучена возможность приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов в присутствии глутарового альдегида. Снижение концентрации эритроцитов, повышение концентрации глутарового альдегида и сыворотки ведут к значительному повышению чувствительности РПГА.

Среди многих химических соединений, обладающих высокой активностью связывания иммунных сывороток, известен ализарин. , в качестве конъюгирующих компонентов испытали следующие ализариновые соединения: ализариновый желтый Р, ализариновый красный С, ализариновый синий БС. В качестве сенситинов использовали неадсорбированные коммерческие сыворотки(салмонелезные, дизентерийные, коли) и препараты иммуноглобулинов класса G.

Совершенно неактивными оказались ализариновый желтый Р и красный С. Чувствительность РПГА с эритроцитами, сенсибилизированными различными сыворотками с помощью ализаринового синего индикатора (АСИ) и ализаринового синего БС, практически не различалась.

С помощью этого метода были сенсибилизированы эритроциты неадсорбированными сыворотками против различных шигелл, салмонелл, эшерихий, бордетелл, холерного вибриона, чумных бактерий, дифтерийного и столбнячного анатоксинов, различных белков. Во всех случаях с (АСИ) были получены высокочувствительные препараты.

Значительной способностью связывать белки обладает амидол. В проведенных опытах показана эффективная сенсибилизация эритроцитов лечебными препаратами гаммаглобулина лошади и иммунными асцитными жидкостями мышей против ряда арбовирусов. Полученные эритроцитарные диагностикумы отличались высокой чувствительностью и специфичностью. , , показали, что риванол активно взаимодействует с белками. Пригодность водных растворов риванола в качестве конъюгирующего агента при сенсибилизации иммуноглобулиновыми препаратами испытывали , Каральник РПГА при сенсибилизации эритроцитов чистыми препаратами lg G и lg A был выше при нагрузке с применением риванола.

Результаты всех этих исследований свидетельствуют о том, что чувствительность, специфичность и рентабельность иммуноглобулиновых диагностикумов при прочих равных условиях (свойства эритроцитов, особенности иммуноглобулинового сенситина) определяются способом сенсибилизации эритроцитов.

____________________

Резюме:

Таким образом, несмотря на то, что способов присоединения белков к поверхности эритроцитов разработано достаточно много, проблема по-прежнему нуждается в дальнейшем изучении, поскольку выбор конъюгирующего агента при сенсибилизации белковыми антигенами достаточно сложен. В связи с этим, особую привлекательность приобретают методы химической конъюгации, принципиальным преимуществом которых является независимость гемосенсибилизации от видового происхождения иммунных сывороток (или выделенных из них глобулинов) и их лиофилизации. Эти методы конъюгации удобны и технологичны, поскольку приготовление диагностикума в этом случае – процесс одноэтапный, не требующий предварительной обработки эритроцитов, как при использовании танина, периодата калия и др. Или как одноэтапный процесс антительной сенсибилизации эритроцитов в кислой среде по способу A. A. Hizata, P. Stashak (1965) без использования конъюгирующих агентов, который малоэффективен из-за низкой чувствительности получаемых эритроцитарных диагностикумов. Поиск новых конъюгирующих компонентов продолжается.

I.I.

«Сенсибилизационная активность карбоксил и азолсодержащих полимеров при конъюгации эритроцитов барана с бактериальными антигенами»

(Результаты исследований)

Учитывая высокую активность изучаемых полимеров во взаимодействии с белками, были отработаны оптимальные условия сенсибилизации эритроцитов барана антигенами: клеточными стенками нетоксигенных коринебактерий дифтерии (вакцина Кодивак), бифидобактерий (бифидобактерин) и лактобацилл (лактобактерин) с помощью поликислот. Учитывались степень полимеризации, концентрации полимеров, объемное соотношение взвеси эритроцитов и раствора полимера.

Перед сенсибилизацией формалинизированные эритроциты барана отмывали охлажденным физиологическим раствором с РН=7,0 и центрифугировали при 15000-20000 g. К одному объему 20% взвеси отмытых от формалина эритроцитов добавляли равный объем полимера разной концентрации от 0,025-2,0мг/мл и перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Затем добавляли белки – один объем (500 мкг/мл) раствора дифтерийного микробного антигена, в другом варианте 0,5 дозы раствора бифидобактерина и в третьем варианте 0,5 дозы раствора лактобактерина. Смеси выдерживали 30 минут на водяной бане при 56 градусах и затем 30 минут при комнатной температуре при постоянном легком перемешивании. Далее трижды отмывали эритроциты от несвязавшегося белка физиологическим раствором с 0,3% раствором БСА, центрифугировали при 15000-20000 g в течение 5 минут. Готовили 8% взвесь сенсибилизированных эритроцитов на физиологическом растворе с добавлением консерванта (азида натрия), взмучивали и подвергали контролю на специфичность и активность.

В работе использовали 0,3-0,8% концентрацию сенсибилизированных эритроцитов. Контроль на специфичность проверяли путем постановки РПГА с использованием контрольных положительных сывороток. Все диагностикумы реагировали с гомологичными кроличьими сыворотками в разведении 1:2-1:256 и выше. Специфичность диагностикумов подтверждена полным торможением РТГА гомологичными антигенами.

Активность приготовленных диагностикумов характеризовали показателем титра специфических антител, которые давали хорошо видимую агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов барана.

Зависимость чувствительности эритроцитарного диагностикума от концентрации полимерной кислоты, используемой в качестве конъюгирующего компонента, определяли на примере (ПМАК – полиметакриловой кислоты) с молекулярной массой 1000 кД по наличию антибактериальных антител в сыворотках крови больных дифтерией в стадии реконвалесценции. Полученные результаты указывают на достаточно высокую чувствительность диагностикума при концентрации полимера 0,2-0,8мг/мл (табл. 1, рис. 1)

Таблица 1

Показатели титра антибактериальных антител к «КД» в log2, в зависимости от концентрации ПМАК в «ЭД»

Концентрация ПМАК в «ЭД» мг/мл	Сыворотки кров больных, содержащие антибактериальные антитела к «КД» (log2, п=10)
0,025	2,1 ± 0,19
0,05	2,7 ± 0,23
0,1	2,7 ± 0,23
0,2	4,0 ± 0,38
0,4	4,0 ± 0,38
0,8	4,8 ± 0,5
2,0	3,5 ± 0,37

Рис. 1. Уровень диагностического титра антибактериальных антител к «КД» в зависимости от концентрации полимерной кислоты (ПМАК, Р-1000) в эритроцитарном диагностикуме

Повышение или понижение концентрации полимера не увеличивало чувствительности эритроцитарных диагностикумов, но способствовало увеличению спонтанной агглютинации эритроцитов.

Далее при конструировании эритроцитарных диагностикумов в качестве конъюгирующего компонента испытывали полиметакриловую кислоту Р – 1000 при концентрации 0,8 мг/мл. Было приготовлено 3 вида эритроцитарных диагностикума с разными антигенами (клеточные стенки коринебактерий дифтерии, бифидобактерий и лактобацилл). Во всех случаях были получены высокочувствительные диагностические препараты по сравнению с диагноститкумами, приготовленными с помощью конъюгирующего компонента хлорида хрома (CrCl3). Сопоставление активности эритроцитарных диагностикумов с ПМАК и CrCl3 указывает на существенно большую чувствительность диагностикумов (Р<0.05), приготовленных c конъюгирующим компонентом – полимерной кислотой (рис 2,3,4). В РПГА с помощью таких тест–систем определялись более высокие титры антибактериальных антител к соответствующим антигенам.

В параллельных опытах было показано, что чувствительность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных с конъюгирующим компонентом ПМАК, в 2-8 раз выше по сравнению с диагностикумом, приготовленным с использованием хлорида хрома (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная характеристика диагностикумов на основе

ПМАК (1000 кД) и хлорида хрома

№ сыворотки	Связывающий агент
CrCl3	ПМАК	CrCl3	ПМАК	CrCl3	ПМК
Диагностикум на антитела
Антимикробные к «КД»	К бифидо­бактериям	К лакто­бактериям
Титры антибактериальных антител
1	1:32	1:256	1:8	1:16	1:4	1:8
2	1:64	1:256	1:8	1:8	1:4	1:8
3	1:32	1:64	1:16	1:16	1:4	1:16
4	1:32	1:256	1:8	1:16	1:4	1:16
5	1:256	1:256	1:8	1:16	1:4	1:16
6	1:32	1:64	1:2	1:8	1:2	1:8
7	1:32	1:64	1:2	1:4	1:2	1:8
8	1:16	1:32	1:8	1:16	1:2	1:16
9	1:32	1:8	1:32	1:128	1:32	1:128
10	отр.	отр.	1:8	1:32	1:32	1:32
11	отр.	отр.	1:16	1:32	1:8	1:32

Рис. 2. Уровень диагностического титра антибактериальных антител в зависимости от связывающего компонента (ПМАК 1000 кД и хлорид хрома). 1 – диагностикум на антибактериальные антитела к «КД», 2 – на антитела к бифидобактериям, 3 – к лактобактериям.

Как показали дальнейшие исследования, сенсибилизационная активность поликислот с эритроцитами увеличивалась с ростом степени полимеризации полимеров (табл. 3, рис. 5.). Так, эритроцитарный диагностикум с конъюгирующим компонентом полиакриловой кислотой (ПАК, М. М. -75 кД) выявлял в РПГА антитела в титрах - 1:4-1:32, тогда как при использовании ПАК с М. М. 1000-2000 кД титры антител в РПГА составляли 1:32-1:128.

Рис. 3. Сравнительная характерис­тика диагностикумов на основе полиметакриловой кислоты (ПМАК) и хлорида хрома при определении антител к бифидобактериям.

Рис.4. Сравнительная характерис­тика диагностикумов на основе полиметакриловой кислоты (ПМАК) и хлорида хрома при определении антител к лактобактериям.

Таблица 3

Влияние природы полимерной кислоты (концентрация - 0,8мг/мл) на чувствительность диагностикума при определении антибактериальных антитела к «КД»

Эритроцитарные диагностикумы на основе полимерных кислот:	№ исследуемой сыворотки
1	2	3	4	5
Полиакриловая кислота, 75 кД	1:32	1:16	1:8	1:4	1:8
Полиакриловая кислота, 750 кД	1:128	1:32	1:8	1:16	1:4
Полиакриловая кислота, 2000 кД	1:128	1:64	1:32	1:16	1:32
Полиметакриловая кислота, 1000 кД	1:128	1:64	1:32	1:32	1:32
Поли-5-винилтетразол, 40 кД	1:64	1:32	1:8	1:4	1:8
Поли-5-винилтетразол, 500 кД	1:128	1:64	1:32	1:16	1:16

Рис. 5. Зависимость диагностического титра антибактериальных антител к «КД» от природы и молекулярной массы полимерной кислоты (концентрация полимера – 0,8мг/мл)

Как известно, введение некоторого количества гидрофобных групп в цепь полимера существенно повышает стабильность образующихся на его основе интерполимерных комплексов. В этой связи следовало ожидать увеличения связующих свойств при переходе от ПМАК к сополимеру метакриловой кислоты с 1-винил-4,5,6,7-тетрагидроиндолом и метилметакрилатом (NХ2). Действительно, как показали исследования (табл. 4), сополимер NХ2 проявлял высокую активность даже при концентрации 0,04мг/мл.

Таблица 4

Результаты испытаний эритроцитарных антигенных диагностикумов на основе сополимеров NX2 (МАК-ВТГИ)

Связывающий компонент в «ЭД»	Титры дифтерийных антибактериальных антител в РПГА
1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256
Сополимер МАК-ВТГИ, 0,8мг/мл	+	+	+	+	+	+	+	±
Сополимер МАК-ВТГИ, 0,04мг/мл	+	+	+	+	+	+	+	-
ПВИ, 0,005мг/мл	+	+	+	-	-	-	-	-
ПВИ, 0,01мг/мл	+	+	+	+	+	+	±	±
Гидрохинон, 0,43% раствор	+	+	±	-	-	-	-	-

Титр специфических антибактериальных антител к «КД» в РПГА составлял 1:128, тогда как при использовании эритроцитарного диагностикума с гидрохиноном титр аналогичных антител определялся в цифрах 1:4-1:8.

В случае применения поливинилимидазола (ПВИ) в качестве связующего агента при концентрациях 0,04-0,08 мг/мл наблюдалась спонтанная агглютинация эритроцитов при замене иммунной сыворотки физиологическим раствором. Понижение концентрации ПВИ до 0,005-0,01 мг/мл позволяло устранить этот эффект при сохранении высокой активности эритроцитарного диагностикума (табл. 4).

Диагностикум с конъюгирующим компонентом ПВИ при концентрации 0,01мг/мл сохранял высокую активность и определял в РПГА титр антибактериальные антител к «КД» в титрах в высоких титрах - 1:64-1:128.

Создаваемые иммуноадъюванты и эритроцитарные диагностикумы базируются на водорастворимых полимерах с функциональными группами (имидазольные, тетразольные), активными во взаимодействиях с белковыми молекулами посредством множественных водородных и/или ионных связей.
Данный подход имеет определенные преимущества по сравнению с
известными системами, основанными на образовании ковалентных связей с белковыми молекулами или гаптенами: более простая и универсальная технология, менее деструктивное воздействие на белковые компоненты (, 2010).

Микрофотографии, полученные на сканирующем электронном микроскопе, показали, что при конъюгации с полимером и сенсибилизации антигеном происходят качественные изменения эритроцита (рис.1).

Таким образом, разработанные эритроцитарные диагностикумы по определению антибактериальных антител к бифидо - и лактобактериям имеют большие возможности при изучении иммунологической реактивности организма к наиболее типичным представителям нормальной микрофлоры кишечника человека. Чувствительные, высокоспецифичные тест-системы позволят более полно осветить еще недостаточно изученные вопросы взаимоотношений макроорганизма и его индигенной микрофлоры.

А Б

В

Микрофотографии (сканирующий электронный микроскоп) исходного эритроцита (А), эритроцита после конъюгации с полимером NX2 (Б) и эритроцита в конечном диагностикуме (В). Масштаб – 1 мкм.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.  , , Саятов иммуноглобулиновых эритроцитарных диагностикумов на основе монорецепторных антител // Вопросы вирусол. – 1989 - №1 – С.115-117.

2.  , , и др. Применение стойкого эритроцитарного диагностикума для определения уровня At к столбнячному анатоксину. // ЖМЭИ – 1968 - №1. – С.54.

3.  Басова серологических реакций, основанных на феномене гемагглютинации // Мат. докл. Всероссийской н-п конф. – Пермь, 1993, - С.26-27.

4.  , , О методике постановки реакции непрямой гемагглютинации с эритроцитами, сенсибилизированными антителами. // Ж. микробиол., - 1966. - №7. – С.97.

5.  , Бимендина комплексы. Алма-Ата. Наука, 1977 – 264 с.

6.  , , Саятов рекомбинантов для приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов к вирусам гриппа // Вопросы вирусол. – 1988 - №5 – С.612.

7.  , Бакаурова водорастворимые полимеры в растворе. – Алма-Ата: Наука, 1981. – 216с.

8.  Денисова реагенты в иммунодиагностики салмонелезов (на модели салмонелеза тифимуриум): Автореф. дисс. канд. мед. наук. – Алматы, 1993.

9.  , , и др. Эритроцитарные диагностикумы для выявления экзотоксина А. // ЖМЭИ – 1989 - №2 – С.32-36.

10.  Дерябин иммунодиагностики гнойно-воспалительных и септических заболеваний при помощи новых эритроцитарных реагентов.: Автореф. дисс. д-ра мед. наук. – Алма-Ата – 1992.

11.  , , Корюшенко и др. Способ приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов для индикации вирусов // Вопросы вирусологии. 1995 - №5 – С.235-237.

12.  Каральник реагенты в клинической иммунологии // Иммунология – 1995 - №7 – С.4-6.

13.  , , и др. Способность конъюгатов бактериального полисахарида с синтетическими полиэлектролитами давать иммунизирующий эффект // Иммунология, - 1983 - №5. – С.41-43.

14.  *Лещук В. В. и др. «Дизайн эритроцитарных диагностикумов с новыми конъюгирующими компонентами, для определения антибактериальных антител». Бюллетень Сибирского отделения РАМН - 2002., Т-1, №4, с 59-62.

15.  *.«Перспективы использования эритроцитарных диагностических систем на основе клеточных антигенов бифидобактерий». ., ., /Материалы Международного конгресса по пробиотикам.// Журнал «Клиническое питание» №21-2 2007г. с. А 80

16.  *, и др. «Сравнительная характеристика эритоцитарных иммунодиагностикумов по определению нармальных бактериальных антител». Бюллетень Сибирского отделения РАМН-2007, №3, с.43-48.

17.  *, и др. «Современные подходы к диагностике, профилактике и коррекции дисбактериозов». Вестник военно-медицинской академии, С-П, 2008, №2(22) с.203-204

18.  *Способ приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума и способ оценки иммунорезистентности организма: Пат, № 21 42142807 РФ: 6 А 61 К З5/ l8, G 01 N ЗЗ/53/ , , (РФ). Заявлено 23.03.96; Опубл. 20.12.99

19.  *, , и др. Новые полимерные системы для иммунологии: адъюванты, гидрогели, функционализированньие покрытия // Фундаментальные науки — медицине:Материалы конф., 10— 11 декабря, 2005 г. - М., 2003, — С, 85-86.

20.  *Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума с применением бактери­альных антигенов бифидобактерий, лактобактерий и полимерных кислот: Патент РФ № 2202801 от 20.04.03 / , , .

21.  Becht H., Maiole B. Comparative evaluation of different fixation procedures and different coupling reagents for the demonstration of influenza virus specific antibodies by the indirect hemagglutination test. // Med. Microbiol. immunol. – 1975 – V.162 – P.43.

22.  Characteristic behavior of the complexation of copper (II) with polymer-bound vinilimidazole ligands / Yoshlmi Kurimura, Toshiyuki Abe, Yoshiharu Usu et. al. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. – 1994. – V.90. - №23. – P.3563-3566.

23.  Inai Y., Kato S., Hirabayashi T., Yokota K. Thermal degradation of sequenceordered copolymers containing methacrylic acid units // Polym. J. – 1995. – V.27, №2. – P.196-200.