Изучение влияния факторов космического полета на изолированные фермент-субстратные системы
Изучение влияния факторов космического полета на
изолированные фермент-субстратные системы
(Константа-2)
Постановщики:
, ст. н. сотр., к. м.н., ОАО «Биопрепарат»;
, профессор, к. х.н., ОАО «Биохиммаш».
Экспедиции: МКС-44, начало в 2015 г.
Область исследования: космическая биотехнология, фермент – субстратные системы.
Необходимость изучения свойств ферментов живых организмов, и, прежде всего человека, в условиях космического полета была уже давно очевидна. Проведенные исследования в период и после пребывания различных биообъектов в условиях космического полета свидетельствуют о развитии явлений дисгармонии тонко настроенных биохимических механизмов гомеостаза и метаболизма, которые на Земле с высокой скоростью и безупречной точностью осуществляют различные фермент-субстратные системы.
Первичные молекулярные реакции синтеза, преобразования и распада многочисленных биогенных веществ, нарушение которых и влечёт за собой развитие патологических процессов, не изучались непосредственно в условиях космического полёта до 2008 г. Наиболее интересным представлялось изучение явления ферментативного катализа, посредством которого происходят все биохимические процессы синтеза, распада и преобразования биологических молекул в живых организмах. Исследование на МКС активности индивидуального фермента в реакции со специфичным субстратом могло бы прояснить вопрос о влиянии на них факторов космического полёта (ФКП).
На борту МКС, начиная с экспедиции МКС-21, реализовался космический эксперимент «Константа» ‑ «Изучение влияния факторов космического полета на активность ферментов».
Техническим заданием на КЭ «Константа» ставилась задача по выявлению наличия и характера влияния ФКП на активность модельного ферментного препарата по отношению к специфическому субстрату. На основе анализа информативности известных фермент-субстратных систем, степени их разработки, для КЭ была выбрана система бутирилхолинэстераза ‑ бутирилтиохолин. В этой системе измеряется единственный параметр ‑ время распада бутирилтиохолина, которое регистрируется по совпадению окраски специального индикатора с цветным эталоном.
В сеансах, проведенных на специально созданной аппаратуре, экспериментально изучена классическая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации специфичного субстрата, рассчитаны значения константы Михаэлиса. Установлено, что в условиях космического (орбитального) полета активность бутирилхолинэстеразы по отношению к бутирилтиохолину значительно выше, чем в синхронном эксперименте на Земле.
Во всех сеансах активность фермента на МКС регистрировалась через 2 ‑ 3 недели в то время, как на Земле ферментативная активность в той же системе полностью отсутствует.
Микрогравитация является наиболее вероятным фактором в условиях орбитального полета, способным оказать такое влияние. Выявленное увеличение активности фермента в этих условиях может повлиять на состояние и функции органов и тканей человеческого организма.
В интересах науки и для закрепления приоритета результатов исследований в частности необходимо их подтверждение на других фермент-субстратных системах или на ферментах других классов (оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы и лигазы).
Краткое описание эксперимента
Начиная с 2015 г., на МКС запланирована реализация космического эксперимента (КЭ) «Константа-2». Цель этого КЭ ‑ выявление наличия и характера влияния факторов космического полета на изолированные фермент-субстратные системы.
Задача КЭ осталась прежней ‑ выявить влияние факторов космического полета на активность ферментного препарата. Для реализации эксперимента используется надёжная многофункциональная научная аппаратура «Константа», уже испытанная в семи сеансах КЭ (рисунок 1).
|
|
Снаряженная кассета | Операция перетеснения |
Рисунок 1 ‑ Экспериментальная кассета
НА «Константа» БТС.086.000.000 состоит из шести укладок, идентичных по своему составу, габаритам и массе. Изготовитель НА ‑ НПП БиоТехСис.
Укладка «Константа» состоит из шести кассет «Константа», каждая из которых представляет собой четыре экспериментальные ячейки, соединенные между собой в единую сборку.
Каждая ячейка состоит из:
– двух емкостей для заправки компонентами – ферментами и субстратом;
– индикаторной ячейки, которая может содержать сорбирующий элемент.
Кассета позволяет проводить одновременно во всех составляющих ее экспериментальных ячейках передавливание рабочих растворов в камеру смешения.
На кассету между реакционными камерами наклеены цветные эталоны. Определение скорости ферментативной реакции осуществляется методом сравнения окраски индикаторного элемента с цветным эталоном как визуально, так и по фотографиям.
Точное измерение времени появления специфического окрашивания реакционной смеси, совпадающего с эталоном ‑ главный параметр такого космического эксперимента.
Объектами исследования являются ферменты, отличающиеся принципом действия (расщепление, синтез) и молекулярной массой, а также и специфические субстраты для этих ферментов.
Для эксперимента «Константа-2» в период МКС-44 был выбран фермент пропионилхолинэстараза, обладающий уникальными свойствами и легко адаптирующийся к научной аппаратуре «Константа».
Значительным преимуществом нового фермента оказалась возможность использования тех же субстрата (бутирилхолинйодид), индикатора (бас-хлор) и фосфатного буфера для создания необходимого значения рН растворителя.
Сырьём для получения ферментного препарата служит некоторые органы кальмаров, которые добываются в Охотском море. Кальмар ‑ головоногий моллюск. У большинства кальмаров имеются три сердца. Среди различных ферментов класса холинэстераз, в том числе электрического ската и электрического угря, пропионилхолинэстараза кальмара отличается наивысшей скоростью катализируемой ей реакции и очень высокой чувствительностью к внешним воздействиям.
Другой особенностью данного фермента является его быстрая инактивация при повышении температуры, поэтому в космическом эксперименте приняты дополнительные мера для охлаждения ёмкостей с пропионилхолинэстаразой.
Выбор пропионилхолинэстеразы кальмара также был методически важен, поскольку позволит максимально использовать существующую научную аппаратуру и методику проведения экспериментов с близкой по структуре и свойствам фермент-субстратной системы.
Задачи, решаемые в процессе проведения КЭ, также как в предыдущем эксперименте, то есть изучение совокупного действия ФКП, присущих орбитальному полету и космическому пространству, на специфическую активность фермента. Общее время, необходимое для проведения сеанса эксперимента на борту определяется циклограммой для каждого сеанса КЭ, поскольку по мере инактивации фермента увеличивается продолжительность наблюдения за процессом.
Учитывая лабильность пропионилхолинэстеразы кальмара для выполнения КЭ дополнительно используются имеющиеся на борту РС МКС термостат ТБУ-В, который обеспечивает температуру укладки плюс 4 ± 2 °С для хранения аппаратуры до начала КЭ и между сессиями КЭ. Другие технических средств для обеспечения внешних по отношению к РС МКС условий эксперимента, не требуется.
Всего для эксперимента снаряжаются две укладки с полностью идентичным составом, навески каждого компонента берутся из одного сосуда. Эксперименты с лётной и наземной кассетами производятся синхронно. Также синхронно регулируется температурный режим внутри укладок. Такой подход позволяет корректно сравнивать прохождение реакции на МКС и на Земле.
Предполётная подготовка НА «Константа» включает:
‑ проведение стерилизации кассет из состава укладки «Константа», оценка качества проведенной стерилизации путем высева из ячеек на тестовые среды;
‑ подготовку рабочих растворов и материалов;
‑ размещение и фиксация дисков реакционных камерах смешения, обработка поверхностей средствами от запотевания, наклейка цветных эталонов;
‑ заправка ёмкостей рабочими растворами, сборка кассет;
‑ проведение дезинфекционной обработки внешних поверхностей кассет, внутренних и внешних поверхностей укладки «Константа»;
‑ передача заправленной аппаратуры представителю ОАО РКК «Энергия» для доставки к месту старта.
Перед началом эксперимента включить видеокамеру и произвести фотографирование исходного состояние кассеты. Затем произвести одновременное перемещение жидкости из емкостей № 1 и № 2 в камеры смешения и включить электронный секундомер. Момент перемещения рабочих растворов является моментом начала эксперимента. Кассету снять с панели, энергично встряхнуть 4 ‑ 5 раз в двух плоскостях и снова закрепить на панели.
Визуально наблюдать за изменением окраски дисков в камерах смешения до её совпадения с цветовыми эталонами (закрепленными на кассете) и провести фотосъёмку. В момент совпадения окраски на диске какой-либо камеры смешения с цветом эталона сфотографировать диск, записать время и продолжить наблюдение за изменением окраски раствора на остальных дисках. Наблюдение и фотографирование может быть прекращено, когда окраска дисков во всех ячейках совпадет с цветом эталона.
Весь эксперимент фиксируется видеокамерой, что позволяет уточнить результаты и оценить работу оператора. Одновременно на Земле проводится такой же эксперимент с идентично снаряженной кассетой. Поскольку активность фермента в процессе КЭ постоянно снижается, быстрое получение результатов КЭ и сопоставление их с наземными экспериментами позволяет оперативно ориентировать космонавта о возможном ходе следующей сессии КЭ.
После возвращения на Землю укладки «Константа-2» и проведения регламентных работ кассеты могут быть использованы для наземной части эксперимента и для тренировок экипажей.
Эксперимент со следующей кассетой из укладки «Константа» выполняется в соответствии с циклограммой через 4 ‑ 7 суток после предыдущего. Время проведения третьей и последующих сессий может быть уточнено после обработки результатов первой и второй сессий и сравнения с наземными экспериментами.
Первый сеанс реализуется в период МКС-44.
Использование результатов эксперимента на Земле
Экспериментальные данные об изменении характеристик реакций биокатализа в условиях орбитального полета дают возможность приблизиться к выявлению причин изменений молекулярных механизмов реакций живой материи в этих условиях.
Такие данные необходимы для создания надежных средств профилактики и защиты от агрессивных факторов окружающей среды.
Использование результатов эксперимента для освоения Космоса
Экспериментальное определение интегрального влияния факторов космического полета на устойчивость и биокаталитическую активность важнейших ферментов млекопитающих дает возможность:
‑ определения возможности как оперативного, так и систематического контроля биохимических показателей космонавтов в условиях космического полета с помощью ферментных тест-систем, что необходимо для реализации длительных космических полетов и колонизации космических объектов;
‑ определения возможных направлений защиты ферментных систем от нежелательных воздействий факторов космического полета.
Результаты будут поступать с 2016 г.
Публикации
Евстигнеев В. И., ОАО «Биопрепарат», Гуреева Е. А., ОАО РКК «Энергия», , ,ОАО «Биохиммаш» (г. Москва), Векслер К. В.,
ОАО «ГосНИИхиманалит», г. Санкт-Петербург «Влияние условий орбитального космического полета на скорость ферментативной реакции». Материалы Международной научно-практической конференции «Научные исследования и эксперименты на МКС»,
2015 г.
