Инженерная энзимология

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра биохимии

ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Практикум

 

МИНСК

2016

УДК 577.15

ББК 28.902

П 69

Рекомендовано Ученым советом

биологического факультета

2016 г., протокол № 3

Составитель :

Рецензенты:

кандидат биологических наук, доцент

Инженерная энзимология. Практикум / сост. : . – Минск. : БГУ, 2016. – 11 с.

Приводятся подробное описание методики постановки системы псевдопероксидазного окисления гемоглобином о-фенилендиамина и определения кинетических параметров процессов.

Для студентов биологического факультета БГУ специальности 1-31 01 01 «Биология (по направлениям)» учебная дисциплина предназначена для студентов направлений специальности 1-31 01 01-01 «Биология (научно-производственная деятельность)» и 1-31 01 01-03 «Биология (биотехнология)»

УДК 577.15

ББК 28.902

© БГУ, 2016

Определение кинетических параметров окисления о-фенилендиамина гемоглобином в присутствии перекиси водорода

Приготовление растворов

1)  Цитратно-фосфатный буфер

Раствор А: в 250 мл дистиллированной воды растворяют: 2,8 г о-фосфорной кислоты (произвести перерасчет в объем (в мл), т. к. о-фосфорная кислота - это жидкость), 6 г лимонной кислоты и 1,77 г борной кислоты. К полученной смеси приливают 170 мл
1н NaOH (рассчитать массу навески, которую необходимо взять, чтобы приготовить
170 мл 1н раствора NaOH).

Для получения цитратно-фосфатного буфера с нужным значением рН 50 мл раствора А помещают в стакан и опускают в него электроды рН-метра. При перемешивании по каплям приливают 0,1н HCl или 0,1н NaOH пока не будет достигнуто нужное значение рН. Процедуру проделывают для каждого буфера отдельно.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Необходимо приготовить буферы со следующими значениями рН:

А) 2,0 (20мл); Б) 3,0 (20мл); В) 4,0 (20мл); Г) 5,0 (200мл); Д) 6,0 (20мл);
Е)7,0 (20мл); Ж) 8,0 (20мл).

Готовые буферы хранят в холодильнике при + 4 °С в течении недели.

2)  Раствор перекиси водорода

В данной работе в качестве рабочего раствора используют 1 М раствор перекиси водорода. Молярную концентрацию стокового раствора определяют через коэффициент молярной экстинции ε 240 нм =46,3 М-1см-1. Раствор перекиси водорода готовят в день проведения эксперимента. Для этого необходимо:

1. Взять у лаборантов исходный раствор перекиси водорода.

2. Приготовить по 1 мл раствора перекиси водорода, разведенного в 10,100,1000,10000 раз. Разводить дист. водой последовательно.

3. Измерить оптическую плотность (А, в ед. опт. пл.) полученных растворов при 240 нм, контроль – дист. вода. Записать полученные значения.

4. По формуле закона Бугера-Ламберта-Бера: с=А/ε*l, (l-длина оптического пути=
1 см), произвести расчет концентрации (с, в моль/л) перекиси водорода в исходном растворе. Обязательно учесть разведение, т. е. полученную цифру необходимо умножить на разведение.

5. Исходный раствор перекиси водорода развести так, чтобы получилось 10 мл 1 М раствора перекиси водорода.

3)  Раствор субстрата ( о-фенилендиамин, о-ФДА).

Готовят рабочий раствор с концентрацией субстрата 6·10 -3 М. Для этого 0,324 г
о-фенилендиамина растворяют в 25 мл диметилформамида, затем объем доводят до 50 мл дистиллированной водой. Готовый раствор субстрата хранят в холодильнике при + 4 °С в течении недели.

4)  Рабочий раствор гемоглобина

В данной работе используют раствор гемоглобина концентрацией 4·10 -5 М. Необходимо рассчитать, какое количество гемоглобина (в мг) понадобиться для приготовления 5 мл раствора. В качестве растворителя использовать дист. воду. Раствор гемоглобина готовят в день проведения эксперимента. Молярная масса гемоглобина 65 000.

Экспериментальная часть

1.  Зависимость начальной скорости реакции окисления о-ФДА от времени и концентрации гемоглобина

В соответствии с таблицей 1 в пробирки последовательно вносят буфер, гемоглобин, субстрат, аккуратно перемешивают при добавлении каждого компонента. Реакцию запускают внесением раствора пероксида водорода непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке).

Таблица 1

№ п/п

Рабочий раствор гемоглобина, мл

о-ФДА, мл

Н2О2, мл

Цитратно-фосфатный буфер (рН 5,0),мл

1 серия

1*

0,005

0,2

0,1

1,695

1 к**

0,005

0,2

-

1,795

2 серия

2*

0,01

0,2

0,1

1,69

2 к**

0,01

0,2

-

1,79

3 серия

3*

0,02

0,2

0,1

1,68

3 к**

0,02

0,2

-

1,78

4 серия

4*

0,05

0,2

0,1

1,65

4 к**

0,05

0,2

-

1,75

*- опытные образцы.

** - контрольные образцы.

Проведение измерений

В качестве контроля используют контрольные образцы соответствующей серии проб. К опытным образцам приливают 0,1 мл 1 М раствора Н2О2, аккуратно перемешивают (одновременно включают секундомер и засекают время начала реакции) и переливают в кювету спектрофотометра. Измерение оптической плотности проводят при
λ = 455 нм (для гемоглобина) в течение
5 минут, записывая значения каждые 15 секунд. Все описанные операции повторяются с остальными сериями проб.

По результатам измерений строят графики зависимости ΔА455 (ΔА405) от времени для каждой концентрации гемоглобина.

Начальные скорости реакции рассчитывают по формуле:

где, l – длина оптического пути;

ε 455нм = 0,61 ·10 4 М-1 см-1 (для гемоглобина);

t (сек) – время реакции, в течении которого ΔА455 носит линейный характер.

Рисунок 1 – Зависимость оптической плотности продуктов окисления о-ФДА гемоглобином в присутствии Н2О2.

Vo

[ гемоглобин]

Рисунок 2 – Зависимость начальной скорости реакции окисления о-ФДА от концентрации гемоглобина

Сделать вывод о проделанной работе.

2.  Зависимость начальной скорости реакции окисления о-ФДА от величин рН

В соответствии с таблицей 2 в пробирки последовательно вносят буфер, гемоглобин, субстрат, аккуратно перемешивают при добавлении каждого компонента. Реакцию запускают внесением раствора пероксида водорода непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке). Все пробы готовят, в одном повторе.

Таблица 2

№ п/п

Цитратно-фосфатный буфер (рН переменный),мл

Рабочий раствор

гемоглобина, мл

О-ФДА, мл

рН

мл

1

Н2О

1,75

0,05

0,2

2

2,0

1,65

0,05

0,2

3

3,0

1,65

0,05

0,2

4

4,0

1,65

0,05

0,2

5

5,0

1,65

0,05

0,2

6

6,0

1,65

0,05

0,2

7

7,0

1,65

0,05

0,2

8

8,0

1,65

0,05

0,2

Проведение измерений

В качестве контроля используют контрольный образец, приготовленный согласно таблице 2. К опытным образцам приливают 0,1 мл 1 М Н2О2 непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке), аккуратно перемешивают (одновременно включают секундомер и засекают время начала реакции) и переливают в кювету спектрофотометра. Измерение оптической плотности проводят при λ = 455 нм (для гемоглобина) в течение 3 минут, записывая значения каждых 10 секунд.

Результаты

Вычисляют значения V0 по формуле указанной в работе №1, строят графики зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от величины рН цитратно-фосфатного буфера (рис. 3). На графиках указывают Vмакс, Km.

Vo

Значение рН буфера

Рисунок 3 - Зависимость начальной скорости реакции окисления о-ФДА от величин рН цитратно-фосфатного буфера.

Сделать вывод о проделанной работе.
3. Зависимость начальной скорости реакции окисления о-ФДА от концентрации перекиси водорода

В соответствии с таблицей 3 в пробирки последовательно вносят буфер, гемоглобин, субстрат, аккуратно перемешивают при добавлении каждого компонента. Реакцию запускают внесением раствора пероксида водорода непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке). Все пробы готовят в одном повторе.

Таблица 3

№ п/п

Н2О2

Цитратно-фосфатный буфер (рН 5,0),мл

о-ФДА, мл

Рабочий раствор гемоглобина, мл

Концентрация в системе,10-2 М

1М раствор Н2О2,

(мл)

1

-

-

1,75

0,2

0,05

2

0,5

0,01

1,74

0,2

0,05

3

1,0

0,02

1,73

0,2

0,05

4

1,5

0,03

1,72

0,2

0,05

5

2,0

0,04

1,71

0,2

0,05

6

3,0

0,06

1,69

0,2

0,05

7

5,0

0,10

1,65

0,2

0,05

8

8,0

0,16

1,59

0,2

0,05

Проведение измерений

В качестве контроля используют контрольный образец (№1) приготовленный согласно таблице 3. К опытным образцам приливают указанное количество 1М Н2О2 непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке), аккуратно перемешивают (одновременно включают секундомер и засекают время начала реакции) и переливают в кювету спектрофотометра. Измерение оптической плотности проводят при
λ = 455 нм (для гемоглобина) в течение
3 минут, записывая значения каждые 10 секунд.

Результаты

Для каждой концентрации Н2О2 вычисляют значение V0 по формуле указанной в работе №1, строят графики зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации перекиси водорода в прямых (рис. 4а) и двойных обратных координатах (рис. 4б).

На графиках указывают Vмакс, Km.

Vo

[Н2О2]

1/ Vo

1/ [Н2О]

Рисунок 4а - Зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации перекиси водорода в прямых координатах

Рисунок 4б - Зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации перекиси водорода в двойных обратных координатах

Сделать вывод о проделанной работе.

4. Зависимость начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации субстрата

В соответствии с таблицей 4 в пробирки последовательно вносят буфер, гемоглобин, субстрат, аккуратно перемешивают при добавлении каждого компонента. Реакцию запускают внесением раствора пероксида водорода непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке). Все пробы готовят в одном повторе.

Таблица 4

№ п/п

о-ФДА

Цитратно-фосфатный буфер (рН 5,0),мл

Рабочий раствор гемоглобина, мл

1М Н2О2, мл

Концентрация в системе, 10-3 М

Рабочий раствор

(мл)

1

-

-

1,85

0,05

0,1

2

0,25

0,0085

1,84

0,05

0,1

3

0,5

0,017

1,83

0,05

0,1

4

1,0

0,034

1,82

0,05

0,1

5

1,5

0,050

1,80

0,05

0,1

6

2,5

0,083

1,77

0,05

0,1

7

3,5

0,117

1,73

0,05

0,1

8

6,0

0,2

1,65

0,05

0,1

В качестве контроля используют контрольный образец (№1) приготовленный согласно таблице 3. К опытным образцам приливают указанное количество 1 М Н2О2 непосредственно перед измерением (поочередно в каждой пробирке), аккуратно перемешивают (одновременно включают секундомер и засекают время начала реакции) и переливают в кювету спектрофотометра. Измерение оптической плотности проводят при
λ = 455 нм (для гемоглобина) в течение 3 минут, записывая значения каждые 10 секунд.

Для каждой концентрации о-ФДА вычисляют значение V0 по формуле указанной в работе №1, и строят график зависимости начальной скорости реакции от концентрации о-ФДА в прямых (см. рис. 5а) и двойных обратных координатах (см. рис. 5б). На графиках указывают Vмакс, Km.

Vo

[о-ФДА]

1/ Vo

1/ [о-ФДА]

Рисунок 5а Зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации субстрата в прямых координатах

Рисунок 5б Зависимости начальной скорости окисления о-ФДА от концентрации субстрата в двойных обратных координатах

Сделать вывод о проделанной работе.

Учебное издание

ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Практикум

Составитель

Кузнецова Екатерина Игоревна

Редактор

Художник обложки

Технический редактор

Компьютерная верстка

Корректор

Подписано в печать. Формат 60´84/16. Бумага офсетная.

Печать офсетная. Усл. печ. л. . Уч.-изд. л. . Тираж экз. Заказ

Белорусский государственный университет.

Свидетельство о государственной регистрации издателя, изготовителя, распространителя печатных изданий № 1/270 от 03.04.2014.

Пр. Независимости, 4, 220030, Минск.

Республиканское унитарное предприятие “Издательский центр Белорусского государственного университета”.

Свидетельство о государственной регистрации издателя, изготовителя, распространителя печатных изданий № 2/63 от 19.03.2014.

Ул. Красноармейская, 6, 220030, Минск.