Электрофорез гемоглобина (в щелочном растворе) с помощью ручной методики
Электрофорез гемоглобина (в щелочном растворе)
С ПОМОЩЬЮ РУЧНОЙ МЕТОДИКИ
МЕТОДОЛОГИЯ
Наборы Hellabio гемоглобин (в щелочи) используются для идентификации различных форм молекул гемоглобина (выделение гемоглобина в отдельные полосы HbA, HbF, HBS (HBG, HBD, Лепор) HbA2 (HBC, HBE и HBO)) и позволяют проводить лабораторную диагностику нормальных и патологических гемоглобинов, определяя состояния, обозначаемые как гемоглобинозы, или гемоглобинопатии.
Каждый из основных типов гемоглобина имеет электрический заряд разной степени, поэтому наиболее эффективным методом разделения и измерения нормального и аномального гемоглобина является электрофорез.
В норме у взрослого человека 96.5-98.5% от общего гемоглобина приходится на HbA. Незначительную долю около 1.5-3,5% занимает HbA2. В период внутриутробного развития основным гемоглобином является HbF.
КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ, ХРАНЕНИЕ.
· Венозную кровь человека (забор производится натощак) поместить в пробирку с сахаром без антикоагулянта (оксалат, гепарин или ЭДТА, обработанная кровь);
Добавить около 100-200 мкл цельной крови в пробирку с 10 мл физиологического раствора, центрифугировать (5 минут при 3g) и удалить супернатант;
· Взять 30 мкл осадка и добавить в пробирку с 130 мкл гемолизирующего раствора, смешать (Гемолизат);
· Гемолизат стабилен в течении 5-7 дней. Хранить в холодильнике, соблюдать условия асептики, избегать попадания прямых солнечных лучей.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
• Работать только в одноразовых перчатках - буфер токсичен.
• Все реагенты должны быть использованы в соответствии с инструкциями, и до истечения даты, указанной на наборе;
• Работа с уксусной кислотой требует наличия вытяжных шкафов;
• Не использовать агарозный гель, если он недостаточно просушен;
• Агарозный гель не замораживать;
• Хранить набор в горизонтальном положении;
• Не использовать гемолизированную сыворотку или плазму (фибриноген).
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1.НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
1. Источник питания 25-250B «Hellabio».
2. Камера для электрофореза «Hellabio».
3. Держатель геля «Hellabio».
4. Набор контейнеров для окрашивания /отмывки «Hellabio».
5. Сушительная камера геля «Hellabio».
6. Вортекс «Micro-Spin», «Minigen.
7. Компьютер, сканер, принтер.
8. Программное обеспечение HELLABIOSCAN GEL ANALYZER или денситометр (520 – 600нм).
9. Набор автоматических пипеток переменного объема.
10. Халат и одноразовые перчатки.
11. Одноразовые микропробирки на 1,5мл.
12. Штатив для микропробирок.
13. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема 5-40 мкм.
14. Емкость для хранения буфера объемом 1000мл.
15. Емкость для хранения окрашивающего раствора объемом 500 мл.
16. Мерный цилиндр объемом 1000 мл.
17. Ножницы.
18. Емкость с дезинфицирующим раствором.
2. НЕОБХОДИМЫЕ реагенты и оборудование – содержаться в каждом наборе Hellabio.
Внимание! Для получения наилучших результатов реагенты, входящие в комплект, должны быть использованы вместе.
Код: | Шаблон/набор |
HE10 | 100 |
HE14 | 140 |
HE28 | 280 |
MHE | 45 |
Содержимое наборов (необходимые реагенты):
Реактив | Объем (мл) | Количество (шт) |
Агарозные гели (Agarose Gels) | - | 10 |
Электрофорезный буфер (Electrophoresis Bufffer) | 40 | 1 |
Окрашивающий раствор (Staining Solution) | 40 | 1 |
Фильтровальные полосы для геля (Gel Blotter Strips) | - | 1 |
Гемолизирующий раствор (Hemolyzing Solution) | 20 мл | 1 |
Шаблоны для образцов (Sample Templates) | - | 1 |
Инструкция (Instruction) на русском и английском языках | - | 2 |
Подготовка реактивов для проведения электрофореза:
Все реактивы фирмы Hellabio должны храниться при температуре 4-25°C до истечения даты, указанной на комплекте. Внимание: буфер токсичен, работать в перчатках.
1. Приготовление рабочего буфера: взять мерный цилиндр на 1000 мл.
2. Развести 40 мл концентрированного буфера(Protein Electrophoresis Buffer) в 960 мл дистиллированной воды.
3. Перелить рабочий буфер в подготовленную емкость и пометить дату, рабочий буфер хранится 3 месяца, с даты изготовления, при комнатной температуре в темном прохладном месте, в закрытой колбе.
4. Приготовление рабочего окрашивающего раствора: хорошо взболтать окрашивающий раствор (Protein Staining Solution).
5. Взять мерный цилиндр на 250 мл и смешать 210 мл 10% уксусной кислоты с 40 мл окрашивающего раствора (Protein Staining Solution).
6. Перелить рабочий раствор окрашивающего раствора в емкость для хранения. Расход окрашивающего раствора обеспечивает возможность постановки соответственно комплектации набора (10 пластинок).
7. В качестве отмывочного раствора будет использоваться 10% уксусная кислота.
Подготовка гемолизата:
· Венозную кровь человека (забор производится натощак) поместить в пробирку с сахаром без антикоагулянта (оксалат, гепарин или ЭДТА, обработанная кровь);
Добавить около 100-200 мкл цельной крови в пробирку с 10 мл физиологического раствора, центрифугировать (5 минут при 3g) и удалить супернатант;
· Взять 30 мкл осадка и добавить в пробирку с 130 мкл гемолизирующего раствора, смешать (Гемолизат);
· Гемолизат стабилен в течении 5-7 дней. Хранить в холодильнике, соблюдать условия асептики, избегать попадания прямых солнечных лучей.
Порядок работы
1. Отобрать необходимое количество микропробирок, включая контроль. Приготовить гемолизат.
2. Заполнить электрофорезные камеры необходимым количеством рабочего буфера в зависимости от объема камеры;
3. Раскрыть упаковку агарозного геля. Используя одноразовый наконечник приподнять пластину агарозного геля (место обозначено стрелкой) и извлечь гель из упаковки. Положить в горизонтальном положении на крышку упаковки.
4. Извлечь фильтровальную полосу (Gel Blotter Strips) из упаковки. Промокнуть гель фильтровальной полосой в зоне нанесения образца (отмечено двумя точками на краях геля). Удалить фильтровальную полосу с агарозного геля.
5. Извлечь шаблон образцов из упаковки (Sample Tamplates). Установить шаблон для образцов в зоне нанесения. Провести указательным пальцем по шаблону, для усиления контакта шаблона с гелем и предотвращения попадания пузырьков воздуха в лунку для образца.
6. В каждую лунку шаблона образцов внести по 5мкл гемолизата и оставить на 20-30сек (не более!).
7. Взять фильтровальную полосу. Промокнуть шаблон образцов фильтровальной полосой. Удалить шаблон образцов и фильтровальную полосу с поверхности геля.
8. Установить гель в гелевый держатель. Опустить гелевый держатель в элекрофорезную камеру. Образцы находятся на катодной стороне.
9. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность. При использывании камеры и источника питания «Hellabio» параметры следущие : напряжение напряжение 200 В, время электрофореза 20 минут (в случае использования мини гелей, на 3 лунки - 18 мин/200 В).
10. Отключить источник питания от электрофорезной камеры. Извлечь гель из гелевого держателя.
11. Поместить гель в сушильную камеру (температура 60°С). Высушить гель полностью (отсутствуют пятна на пластине геля).
12. Заполнить один контейнер рабочим окрашивающим раствором, три контейнера 10% уксусной кислотой.
13. Поместить высушенную гелевую пленку в контейнер для окрашивания на 5 минут.
14. Извлечь окрашенную гелевую пленку. Промыть пленку по 5 минут в 3-х контейнерах для промывки.
15. Поместить гель в сушильную камеру (температура 60°С). Просушить гелевую пластину.
16. Перенести гель в сканер. Получить изображение геля и оценить результаты в программе HellabioScan или используя фильтр денситометра 580 нм.
Предполагаемые показатели нормы: HbA: 96.5-98.5%, HbA2 1.5-3.5%
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Точность:
Коэффициент отклонения значений не превышает 5%.
Контроль:
Гемолизат известного гемоглобина или коммерчески доступный гемолизат контроля качества должен быть включен в каждую процедуру электрофореза.
Интерпретация результатов:
Качественная интерпретация результатов может быть произведена визуально путем сравнения образца с шаблоном. Для количественной интерпретации результатов используют программу HellabioScan или денситометр (580нм)
Калибровка:
Оценку электрофореграмм при гемоглобинопатиях можно легко сделать визуально. Для количественного анализа должен быть использован денситометр (580нм).
МОДЕЛИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА АГАРОЗНЫХ ГЕЛЯХ HELLABIO
HbA/S/A2 | Электрофорез гемоглобина в щелочи: 1: HbS(HbG, HbD, HbLepore) 2-4: Норма |
|
|
| |||
HbF/A/S | Электрофорез гемоглобина в кислоте: (Дифференциация HbS от HbG, D,Lep.) 1= HbS 2-4= Норма |
|
|
| |||
HbA/F/A2 | Электрофорез гемоглобина в щелочи: 1= HbF 2-4= Норма |
|
|
___
___
Примечание: чтобы определить вид нетипичного гемоглобина (HbC, HbS, HbD, HbE, Lepore), нужно использовать электрофорез гемоглобина в кислой среде.
Основные порталы (построено редакторами)