ОБНАРУЖЕНИЕ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС БЕЛКА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИКОНСОЛИДАЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ.
.
Институт физиологии им. АН, Баку, Азербайджан.
В статье описаны идентификация и выделение из головного мозга белых крыс белка, находящегося под регуляторным влиянием серотонин-модулируемого белка SMP-69. Под влиянием внутримозгового введения крысам антител к белку SMP-69 наблюдалось увеличение активности генетического аппарата клеток коры головного мозга и значительное увеличение содержания электрофоретической фракции №28. Внутримозговое введение крысам очищенного белка вызывало нарушение процесса консолидации памяти. Делается заключение о существовании в нервных клетках механизма молекулярного выключателя, регулирующего процесс консолидации следов памяти.
Ключевые слова: кора головного мозга, активность генома, белки, консолидация памяти.
Большинство исследователей при изучении роли отдельных белков в функционировании нервных клеток и головного мозга в целом пользуются блокадой их активности моноспецифическими антителами [5,13,14] или избирательным выключением соответствующих генов антисмысловой последовательностью нуклеотидов, или же работают на трансгенных животных, лишенных каких-либо определенных генов [9,11,12, 15]. Такой подход, нацеленный на исследование функций в условиях блокады или отсутствия изучаемого белка, вероятно, основан на положении о том, что в нервных клетках присутствует оптимальное для их функционального состояния количество различных белков, задействованных в реализации специфических функций. Поэтому добавление извне изучаемого белка может не привести к существенным изменением регистрируемых функций или поведенческих показателей. По-видимому, этим объясняется небольшое количество исследований, в которых исследователи использовали сами белки для изучения их функциональной активности [3]. Кроме того, на сегодняшний день подавляющее количество выделенных из мозга белков обладают стимулирующимим свойствами в отношении различных функций клеток головного мозга, поэтому для их исследования более адекватными являются подходы, основанные на блокаде активности этих белков.
Несмотря на множество публикаций, посвященных исследованию роли различных белков в процессах памяти, до сих пор нет достаточной ясности в том, каким образом эти белки вовлечены в процесс консолидации следов памяти. Более того, если к настоящему времени экспериментальным путём удалось приблизиться к пониманию субстрата хранения приобретенной информации в нервных клетках, то механизм регуляции записи этой информации не разработан вовсе.
В ранее проведенных исследованиях из головного мозга крыс был выделен новый серотонин-модулируемый белок SMP-69 (мол. маcса 69 кДа, рI 6,0) [6]. Внутримозговое введение крысам антител к нему приводило к нарушениям консолидации следов памяти в модели пассивного избегания. Из этого наблюдения было сделано заключение о стимулирующем регуляторном влиянии белка SMP-69 на процессы консолидации памяти. Исходя из установленных фактов о причастности генетического аппарата клеток головного мозга к процессам консолидации памяти, а также из положения о том, что белок SMP-69, вероятно, является продуктом ранних генов, представляло интерес изучение влияния антител к белку SMP-69 на активность генома с последующей идентификацией и выделением белков, синтез которых изменяется в условиях его блокады.
Mетодика исследования.
Изучение влияния антител на процессы транскрипции осуществляли следующим образом. Крысам опытной группы (n=4) под эфирным наркозом в левый боковой желудочек вводили антитела к белку SMP-69, контрольной (n=4) - неиммунные g-глобулины, через 24 ч их под эфирным наркозом декапитировали, извлекали кору головного мозга, гомогенизировали в инкубационной среде, содержавшей 40 мМ трис-НСl (рН 7,2), 100 мМ KCl, 10 мM MgCl2 и 0,2 мМ этилдиаминтетраацетата (ЭДТА). В каждую пробу добавляли по 3 мкКи [3H]-уридина и инкубировали в термостате при температуре 30оС в течение 30 мин. Реакцию транскрипции останавливали добавлением в каждую пробу раствора, содержавшего 7,5 М мочевины, 0,5%-ного додецилсульфата натрия (ДСН), 10 мМ ЭДТА и 10 мМ трис-HCl (рН 8,0). Производили экстракцию молекул РНК [7] и измеряли поглощение раствора РНК на длине волны 260 нм и вычисляли отношение поглощений А260/А280, которое равнялось 2. Пробы РНК нейтрализовывали добавлением ледяной уксусной кислоты и приливали во флаконы, содержавшие по 5 мл толуольного сцинтиллятора. Флаконы помещали в бета-счетчик “Бета-1”, просчитывали количество разрядов меченых атомов в течение 1 мин и рассчитывали отношение количества разрядов к значениям поглощения.
При проведении опытов по изучению влияния антител на процессы трансляции также крысам опытной группы (n=4) под эфирным наркозом в левый боковой желудочек вводили антитела к белку SMP-69, контрольной (n=4) - неиммунные g-глобулины, через 24 ч их под эфирным наркозом декапитировали, извлекали кору головного мозга, гомогенизировали в инкубационной среде, содержавшей 100 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2 и трис-HCl буфера (рН 7,5), приливали в каждую пробу по 3 мкКи [3H]-лейцина и инкубировали в термостате при температуре 37оС в течение 30 мин. Осуществляли экстракцию суммарных белков [4] и измеряли поглощение проб на длине волны 280 нм/1,4 в спектрофотометре СФ-46. Пробы нейтрализовывали добавлением равного объема ледяной уксусной кислоты и приливали в сцинтилляционные флаконы, содержавшие по 5 мл толуольного сцинтиллятора. Флаконы с пробами помещали в бета-счетчик “Бета-1” и просчитывали каждую пробу в течение 1 мин. Результаты счета импульсов радиоактивных разрядов относили к результатам поглощения и сравнивали по t-критерию Стьюдента.
Изучение влияния антител к белку SMP-69 на содержание отдельных белковых фракций осуществляли по описанной выше временной схеме. После декапитации животных опытной (n=6) и контрольной (n=5) групп извлекали кору головного мозга крыс, гомогенизировали на холоду в экстрагирующем буфере, содержавшем 0,05 М фосфатный буфер (рН 7,4), 0,3 М NaCl, 0,1% тритона Х-100 и 5 мМ ЭДТА, центрифугировали и диализовали против 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,2). Фракционирование белков осуществляли методом электрофореза в градиенте плотности 4-30% полиакриламидного геля на вертикальных стеклянных пластинах величиной 20 Х 25 см с постоянным водяным охлаждением. Электрофорез продолжался в течение 15 ч в электрическом режиме 0,8 мА/см. По окончании электрофореза гелевую пластинку извлекали, фиксировали в 12,5 %-ном растворе трихлоруксусной кислоты, окрашивали 0,1%-ным раствором CBB R-250, содержавшем 25% этилового спирта и 8% ледяной уксусной кислоты, и денситометрировали в денситометре ДМ-1 (пр-во завода Медицинского оборудования, С.-Петербург). Производили расчёт относительного содержания отдельных белковых фракций и сравнивали по t-критерию Стьюдента.
Выделение белка осуществляли под контролем твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планщетах с использованием иммуноглобулинов к электрофоретической белковой фракции №28. Иммуноглобулины получали путем иммунизации кроликов в течение 3 месяцев указанной фракцией, вырезанной из окрашенной гелевой пластинки по окончания электрофореза, всегда в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Основными этапами выделения белка были: 1) дробное осаждение сульфатом аммония в интервале насыщения 0-40%; 2) гель-хроматография на колонке (1,8 Х 60 см) сефадекса G-150. Гомогенность белка контролировали методом электрофореза в 5%-ном полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (рН 8,7). Молекулярную массу белка определяли методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия с использованием белков-стандартов.
Изучение влияния выделенного белка на процессы памяти осуществляли в модели пассивного избегания у крыс. В первой серии исследований выделенный белок вводили за 24 ч до сеансов обучения в левый боковой желудочек наркотизированным крысам (n=16) в концентрации 1,5 мг/мл и объеме 10 мкл. Контрольным животным (n=12) вводили физиологический раствор, забуференный фосфатом до рН 7,3. При обучении животных помещали в светлый отсек экспериментальной камеры и, когда они заходили в темный отсек, их наказывали ударом электрического тока (0,8 мА), после чего они возвращались в светлый отсек, откуда их извлекали. Тестирование сохранения навыка осуществляли через 48 ч после сеансов обучения в течение 5 мин (в темном отсеке животных не наказывали ударом тока). Во второй серии экспериментов (8 подопытных и 7 контрольных крыс) белок вводили через 48 ч после сеансов обучения за 24 ч до тестирования сохранения навыка. Достоверность отличий полученных результатов оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследования.
В экспериментах с использованием меченых предшественников синтеза РНК и белков было обнаружено, что антитела к белку SMP-69 при внутримозговом введении крысам оказывают заметное влияние на процессы транскрипции и трансляции в нервных клетках. В частности, под влиянием внутримозгового введения антител за 24 ч до декапитации наблюдалось увеличение синтеза РНК на 36,7% и увеличение синтеза белков на 29,6% по сравнению с контролем (Рис. 1).
При исследовании влияния внутримозгового введения антител к белку SMP-69 на содержание отдельных белков было выявлено значительное (84%; p<0,001) и воспроизводимое увеличение содержания электрофоретической белковой фракции №28 (Рис. 2, Табл.). Для последующего изучения было осуществлено выделение идентифицированной белковой фракции: белок состоял из двух субъединиц со значениями молекулярной массы 126 и 60 кДа. При внутримозговом введении выделенного белка животным опытной группы за 24 ч до сеансов обучения наблюдалось выраженное нарушение процессов памяти. В частности, в сеансах тестирования 87,5% животные опытной групп заходили в темный отсек по сравнению с 8,3 % в контрольной группе (p<0,001; Рис. 3А). При введении выделенного белка через 48 ч после сеансов обучения достоверной разницы в сохранении навыка между животными опытной и контрольной групп выявлено не было (Рис. 3Б). При регистрации поведения животных обращало на себя внимание повышенная исследовательская активность крыс опытной группы. На основании описанных результатов было сделано заключение об ингибирующем влиянии выделенного белка на процессы консолидации памяти и об отсутствии каких-либо эффектов на процессы её хранения и воспроизведения. Исходя из выявленной функциональной активности, белок был назван «антиконсолидационным».
Анализ полученных данных и результатов ранее проведенных исследований позволяет придти к заключению о том, что белок SMP-69 и антиконсолидационный белок, присутствующие в нервных клетках, участвуют в регуляции процесса консолидации следов памяти. При этом указанные белки выполняют противоположные функции: белок SMP-69 индуцирует консолидацию следов памяти, тогда как антиконсолидационный белок блокирует запись поступающей информации. Таким образом, процесс консолидации приобретеной памяти в клетах коры головного мозга, по-видимому, управляется механизмом, работающим по принципу молекулярного выключателя. Такой принцип, следующий режиму «всё – или ничего», предполагает наличие специализированного субстрата-матрицы для записи и хранения приобретённой информации. Исходя из режима работы механизма молекулярного выключателя, трудно принять проторение и новообразование синапсов нервных клеток в качестве субстрата-матрицы приобретенной памяти. Результаты исследований ряда авторов, обнаруживших повышение синтеза ДНК при выработке новых навыков [1,9], позволяют полагать, что хранилищем приобретённой памяти в нервных клетках, по-видимому, являются молекулы ДНК. Возможность записывания и хранения приобретённой памяти на молекулах ДНК в процессе постнатального онтогенеза подробно обсуждал в своих трудах [2]. Кроме того, аргументом в пользу записывания приобретённой информации на молекулах ДНК является тот факт, что в процессе онтогенеза уровень экспрессии уникальных генов клеток коры головного мозга человека значительно возрастает (от 8% до 38%), в то время как в структурах головного мозга, не связанных с фиксацией следов памяти, таких как продолговатый мозг, экспрессия уникальных генов остаётся на неизменном уровне, как и в других тканях [8].
Литература
1. , // Успехи физиол. наук, 1993, 24, №3, с.53-70.
2. Анохин по физиологии функциональных систем. М., 1975.
3. , , // Журнал высш. нерв. деят., 1991, 41, №1, с. 60-65.
4. // В кн.: Транскрипция и трансляция. Методы. М., 1987, с.277-326.
5. , , // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 1987, 104, №8, с. 139-141.
6. , , // Журнал высш. нерв. деят., 1998, 48, №6, с.1107-1110.
7. Мэнли Дж.// В кн.: Транскрипция и трансляция. Методы. М., 1987, с.89-110.
8. Системогенез и проблемы генетики мозга. М., 1883.
9. Giuditta A., Ambrosini M. V., Perrone C. C., Menna T., Rafti F., Lamberti C., Sadile A.// J. Neurogenet., 1985, 2, N2, p.143-145.
10. Larson J., Lynch G., Games D., Seubert P.// Brain Res., 1999, 840, N1-2, p.23-35.
11. Mogil J. S., Grisel J. E.// Pain, 1999. 77, N2, p.107-128.
12. Nestler E. J., Kelz M. B., Chen J.// Brain Res., 1999, 835, N1, p.10-17.
13. Nolan P. M., Bell R., Regan C. M.// Neurosci. Lett., 1987, 79, N3, p.346-350.
14. Piront M.-L., Scmidt R.// Brain Res., 1988, 442, N1, p.53-62.
15. Steckler T., Weis C., Sauvage M., Mederer A., Holsboer F.// Behav. Brain Res., 1999, 100, N1-2, p.77-89.
