Биохимия

БИОХИМИЯ

УДК 577.3; 577.353; 581.182.1; 582.374.22; 591

Cократительные белки в трансдукции хемосигнала растительных микроспор

© 2005 г.

Институт биофизики клетки РАН, Институтская ул.,3, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

E. mail: *****@***psn. ru

Поступила в редакцию 18.10.2004 г.

На одноклеточных системах изучено участие контрактильных компонентов в передаче хемосигнала с поверхности клетки к органеллам. В качестве хемосигналов использовали нейротрансмиттеры дофамин и серотонин, а также активные формы кислорода пероксид водорода и tert-бутилпероксид. Объектами исследования служили вегетативные микроспоры хвоща полевого Equisetum arvense и генеративные микроспоры - пыльца гиппеаструма Hippeastrum hybridum, которые обрабатывали растворами цитохалазина В (ингибитора полимеризации актина в микрофиламентах), колхицина и винбластина (ингибиторов полимеризации тубулина в микротрубочках). У обоих типов микроспор после такой обработки наблюдали ингибирование развития, особенно сильно цитохалазином. При этом отмечена также возросшая характерная голубая флуоресценция отдельных участков клетки (вдоль клеточных стенок, вокруг ядер и хлоропластов), где, вероятно, располагаются соответствующие контрактильные белки. В отличие от антиконтрактильных агентов, дофамин, серотонин и пероксиды вызывали стимуляцию прорастания микроспор. Предварительная обработка микроспор цитохалазином и колхицином, а только затем - серотонином или дофамином или пероксидами, вызывала снижение прорастания микроспор. Предполагается, что передача хемосигналом информации с поверхности внутрь клетки к ядру связана с актином и тубулином.

Развитая сеть белковых нитей (филаментов) образует в цитоплазме клеток опорно-двигательную систему, называемую цитоскелетом. С помощью этой системы происходят видимые перемещения органелл и частиц в клетке. Контрактильные белки актин, миозин и тубулин, входящие в состав цитоскелета, обнаружены у всех живых организмов.

Кроме структурной и двигательной функций, цитоскелет может участвовать и в сенсорных реакциях клетки в процессах сигнализации (Staiger, 2000). Исследования связи контрактильных систем с хемосигнализацией проводили на ооцитах в Институте биологии развития РАН, рассматривая как тесты деление и рост клеток и используя нейротрансмиттеры в качестве природных хемосигналов (Бузников, 1987). Подобные проблема интересна и для исследователей растительных клеток, поскольку нейротрансмиттеры ацетилхолин и биогенные амины найдены и в растениях, где выполняют регуляторную и сигнальную функции (Рощина, 1991; Roshchina, 2001).

Среди одноклеточных систем для исследований хемосигнализации заслуживают внимания микроспоры растений как возможные модели (Roshchina, 2004a, b). Микроспоры представляют собой чувствительные одиночные клетки, покрытые многослойной защитной оболочкой, поверхностная часть которой называется экзиной, где непосредственно действует внешний сигнал и затем передается плазматической мембране. Это одноклеточные системы крупного размера ( > 20 мкм), хорошо видимые под микроскопом, с которыми возможны манипуляции. Структуры таких клеток удобны для прижизненного анализа с помощью новейшей аппаратуры (сканирующей микроскопии, микрофлуориметрии, микроспектрофотометрии и др.). Микроспоры способны к быстрому делению и росту при культивировании на искусственных средах. Они служат для размножения растений. Вегетативные микроспоры (с диплоидным набором хромосом) характерны для споровых растений, тогда как генеративные микроспоры, называемые иначе мужской гаметофит или пыльца (ординарным набором хромосом мужских гамет) – для семенных растений. Первый тип клеток включает хлоропласты и способен к автотрофному питанию в природе и любой водной среде, и путем деления образует многоклеточный таллом – гаметофит. Пыльца (генеративные споры) прорастает на рыльце пестика в цветке своего вида или вне его в условиях культивирования, образуя пыльцевую трубку, амебо-подобный вырост, по которой передвигаются мужские гаметы – спермии (клетки возникающие внутри споры в результате деления ядра). Пыльцевая трубка служит для доставки спермиев к яйцеклетки семяпочки – будущей завязи, где один из спермиев затем сливается с женской клеткой, и так происходит оплодотворение.

Роль контрактильных агентов в трансдукции хемосигнала до сих пор на микроспорах специально не исследовали. Известно, что прорастание пыльцы, оцениваемое по появлению и росту пыльцевой трубки, зависит от активности сократительных белков актина и миозина (Ren et al., 1997; Taylor, Hepler, 1997; Cai et al., 2000; Chen C. Y. et al., 2001; Vidali et al., 2001). Более того, продемонстрировано присутствие динамичной формы F-актина, локализованного в верхушке пыльцевых трубок табака (Ying Fua et al., 2001). Развитие микроспор чувствительно к различным химическим воздействиям. Как природные хемосигналы для инициирования прорастания пыльцы, могут служить активные формы кислорода, постоянно возникающие на поверхности любых клеток в процессе жизнедеятельности, в частности генераторами их служат нейротрансмиттеры катехоламины (Сhen et al., 2001), и в результате взаимодействия с озоном атмосферы (Roshchina, Roshchina, 2003; Roshchina et al., 2003).

Целью данной работы было выявить связь между состоянием цитоскелета и передачей хемосигнала с поверхности внутрь клетки к органеллам.

Материалы и Методы

Объектами исследования служили вегетативные микроспоры хвоща полевого Equisetum arvense и пыльца гиппеаструма Hippeastrum hybridum. Оба объекта легко прорастают на искусственных питательных средах или просто в воде и хорошо видны под обычным и люминесцентным (после возбуждения ультрафиолетовым 360-380 нм светом) микроскопом. Методика их исследования описана в наших предыдущих публикациях подробно (Roshchina et al., 2002; 2003; Roshchina, 2004). Развивающаяся вегетативная микроспора сбрасывает оболочку, флуоресцирующую голубым светом, и остается делящаяся клетка, светящаяся в красной области спектра. Инициацию прорастания вегетативных микроспор оценивали путем подсчета клеток, ярко флуоресцирующих красным светом. За 2 ч флуоресценция усиливается в 2 раза - идет деление клетки, и количество синтезированных флуоресцирующих пигментов – хлорофилла и, в меньшей мере, азуленов, удваивается, что регистрируется с помощью микроспектрофлуориметра (Рощина и др., 2002, 2003; Roshchina, 2004a). Развитие пыльцы оценивали по числу пыльцевых зерен, образовавших пыльцевую трубку (Рощина и др. 1998; 2003; Roshchina, 2004b). Для оценки роли цитоскелета в хемосигнализации использовали антиконтрактильные агенты цитохалазин В фирмы Sigma CША, колхицин и винбластин фирмы Merk Швейцария, а в качестве хемосигналов – нейротрансмиттеры серотонин, дофамин, норадреналин фирмы Sigma CША, и пероксиды – перекись водорода фирмы Биолаб Россия и tert-бутилпероксид фирмы Fluka Швейцария. Развивающиеся микроспоры фотографировали под люминесцентным микроскопом фирмы Karl Zeiss.

Результаты и обсуждение

Для исследовании роли цитоскелета в развитии микроспор использовали цитохалазин В, связывающий контрактильный белок актин, а также колхицин и винбластин, вызывающие ингибирование самосборки контрактильного белка тубулина. В наших опытах после обработки исследуемых микроспор указанными выше антиконтрактильными агентами наблюдалось ингибирование их развития. Данные для цитохалазина и колхицина приведены на рис. 1 (не иллюстрировано для винбластина, который ингибировал рост микроспор примерно в такой же степени как и колхицин). Количество проросших микроспор обоих типов заметно снижалось в присутствии испытуемых веществ, но отмечены различия в их действующих концентрациях. Из концентрационных кривых (рис. 1) видно, что колхицин вызывал эффект в более высоких концентрациях, чем цитохалазин. Особенно заметными были различия в варианте с пыльцой, где образование пыльцевой трубки почти полностью подавлялось при концентрации цитохалазина 10–6М, тогда как в той же концентрации колхицин только на 20-30 % снижал количество пыльцевых зерен с хорошо видимой пыльцевой трубкой. Для вегетативных микроспор различия в действующих концентрациях антиконтрактильных агентов были не столь заметны. Нарушение механизма прорастания микроспор цитохалазином В может происходить из-за связывания актина, белка актомиозиновых филаментов. В результате этого нарушается полимеризация актина и, соответственно дальнейшее нарастание нитей этих филаментов, что обуславливает рост клетки растяжением. Для образования пыльцевой трубки рост растяжением имеет решающее значение, и его нарушение какими-либо веществами, связывающими актин, блокирует прорастание пыльцы (Taylor, Hepler, 1997). Присутствие актина в цитоплазме пыльцевой трубки табака и других растений показано в опытах c другими красителями, такими как Texas-red –фаллоидином и антителами на актин (Сhen et al., 2001; Ying Fua et al., 2001). Колхицин и винбластин, связывая тубулин, препятствуют его самосборке в микротрубочках. Колхицин разрушает лабильные микротрубочки митотического веретена, движение хромосом к полюсам клетки с помощью которых осуществляется по принципу скольжения, и деление задерживается на стадии метафазы. В литературе мы не встретили упомянаний о влиянии цитохалазина и колхицина на вегетативные микроспоры хвоща. Наши данные указывают на присутствие актина и тубулина в этих клетках. Показано, что присутствие микротрубочек в пыльцевой трубке табака обусловливает передвижение органелл и спермиев (Сai et al., 2000). У нашего объекта гиппеаструма в присутствии довольно высоких (до10-4 М) концентраций колхицина, если и образовывалась, то измененная (часто спирализованная) пыльцевая трубка. Все использованные антиконтрактильные агенты нарушали инициацию проростания сухих микроспор после их смачивания питательной средой, что, вероятно, связано с торможением прохождения сигнала с поверхности внутрь клетки к ядру. Следовательно, развитие микроспор связано с участием в этом процессе контрактильных белков актина и тубулина, основных структурных элементов цитоскелета.

Под влиянием антиконтрактильных агентов наблюдается заметное изменение флуоресценции клеток (рис. 2). Сами по себе цитохалазин, колхицин и винбластин в растворе светятся очень слабо. Смоченные питательной средой мироспоры или слабо светятся (как пыльца и пыльцевые трубки) или светятся слабо в голубой-желтой и заметнее в красной областях спектра (как вегетативные микроспоры). В присутствии колхицина свечение обоих видов микроспор в сине-зеленой области спектра заметно возрастало, что видно и по изменению их спектров флуоресценции (рис. 3). Причем ярче всего светились ядра вегетативной клетки пыльцы и спермиев. Небольшое увеличение свечения наблюдали и вдоль стенок пыльцевых трубок. Воздействие колхицином приводило к выявлению характерной голубой флуоресценции, особенно ядер и цитоплазмы. В вегетативных микроспорах подобная люминесценция заметна и в хлоропластах. Это свечение наблюдали в вегетативных микроспорах и в пыльце, а также вдоль стенок пыльцевых трубок. В вегетативных микроспорах появляется такая же голубая флуоресценция у элатер, гибких структур, которыми микроспора хвоща прикрепляется к субстрату. Это указывает на присутствие микротрубочек, состоящих из тубулина. Именно локализацией в элатерах таких контрактильных структур, вероятно, обусловлены их гибкость и подвижность. Таким образом, уже по эффектам, вызываемым контрактильными агентами, можно судить о состоянии и локализации элементов цитоскелета. Изменение под влиянием этих веществ флуоресценции отдельных клеточных компартментов, где расположены сократительные системы, может быть полезно для использования антиконтрактильных агентов в качестве флуоресцентных красителей на актин и тубулин.

Как ранее было установлено (Рощина и др. 1998; Roshchina, 2004b; Roshchina, Roshchina, 2003; Roshchina et al., 2003), хемосигнальные вещества серотонин, дофамин, перекись водорода и tert-бутилпероксид в концентрациях 10-6-10-5М стимулируют прорастание обоих типов микроспор. В наших опытах были изучены эффекты антиконтрактильных веществ на развитие микроспор в присутствии нейротрансмиттеров серотонина и дофамина, а также активных форм кислорода пероксидов как хемосигналов (рис. 4). Предварительная обработка микроспор цитохалазином В или колхицином, а только затем - серотонином или дофамином или пероксидами, вызывала не стимуляцию, а снижение количества проросших микроспор (рис.4). Таким образом, стимуляция прорастания нейротрансмиттерами или пероксидами подавляется антиконтрактильными препаратами, что, по-видимому, связано с повреждением цитоскелета, поскольку процессы роста и деления клеток контролируются хемосигналами, полученными от этой упорядоченной системы. Вероятно, передача хемосигнала, будь то нейротрансмиттеры серотонин и дофамин или пероксиды, внутрь клетки к ядру связана с актином и тубулином.

Как передается хемосигнал сигнал другим органеллам, содержащим нуклеиновые кислоты, пока не установлено. Нарушение передачи хемосигнала внутрь клеток микроспор к ядру или другим органеллам, особенно к хлоропластам у вегетативных микроспор хвоща, хорошо заметно, поскольку развитие таких клеток оценивалось по изменению красной флуоресценции, связанной с хлорофиллом. Ранее было обнаружено, что цитохалазин В значительно ингибирует синтез АТФ в процессе нециклического фотофосфорилирования в изолированных хлоропластах гороха, а катехоламины, в том числе дофамин, напротив. стимулируют (Roshchina, 1990). После предобработки изолированных пластид цитохалазином В, а затем катехоламинами, скорость этого процесса заметно снижается, что указывает на одну и ту же мишень связывания веществ в мембранах. Есть публикации, которые свидетельствуют в пользу участия актина и миозина в транслокации хлоропластов в клетке (Kurodа, Kamiya, 1975; Schönbohm, Meyer-Wegener, 1989; Takagi Shingo, 2003). Возможно, имеет место ассоциация актиновых микрофиламентов с АТФ синтетазой. Полагают, что актин может располагаться в близко примыкающих к поверхности хлоропласта тяжах цитоплазмы, обуславливающей движение этой органеллыа также и внутри хлоропластов (Wagner et al., 1972; Kuroda, Kamya, 1975; Takagi, 2003). Во всяком случае из хлоропластов были выделены актино-подобный белок 41 кДА (McCurdy, Williamson, 1987) и миозино-подобный белок (Knight, Kendrick-Jones, 1993). Еще в работе (Wagner et al., 1972) было показано обратимое влияние цитохалазина В на движение хлоропластов, связанное с актиновыми филаментами. Это свидетельствует о возможности участия контрактильных элементов в сигнализации, поскольку реакция на ингибитор кратковременная и обратимая.

Возросшая после обработки цитохалазином В флуоресценция растущей микроспоры показывает присутствие актина в цитоплазме пыльцевой трубки. Это согласуется с данными экспериментов на пыльце разных растений, обработанных другими молекулярными пробами и красителями, а также с работами по выделению и очистке этого белка (Taylor, Hepler, 1997; Ren, 1997; Chen C. Y. et al., 2001). Воздействие колхицином и цитохалазином В также приводит к выявлению характерной голубой флуоресценции клеток. Окрашивание препаратов микроспор колхицином указывает на присутствие тубулина. Ранее в экспериментах на растворах было установлено, что в присутствии изолированного и очищенного тубулина флуоресценция колхицина при 430-460 нм значительно усиливается (Bhattacharyya et al., 1986). В наших опытах после обработки колхицином появлялось свечение вокруг ядер и в пристенной цитоплазме пыльцевой трубки. В вегетативных микроспорах ярко светится ядро, и появляется голубое свечение хлоропластов. Таким образом, гистохимическое окрашивание колхицином может использоваться для выявления локализации тубулина в клетках.

В заключение остановимся на возможной роли сократительных белков в хемосигнализации в процессе развития микроспор. Стимуляция развития микроспор биогенными аминами или пероксидами как хемосигналами – триггерами прорастания не наблюдается, если клетки предварительно обработаны антиконтрактильными агентами на актин и тубулин. Связывание с актином приводит к большему угнетению роста, чем связывание с тубулином. Взаимодействие нейротрансмиттеров или пероксидов с плазматической мембраной осуществляется путем контакта с предполагаемыми рецепторами. В этих же участках плазмалеммы вероятно и связывание антиконтрактильных агентов, хотя они проникают также внутрь клетки и непосредственно связываются с соответствующими белками двигательных структур. Хемосигнализация может осуществляться с участием контрактильных белков как во взаимодействиях рецептор-трансдуцин (реализуемых через вторичные мессенджеры кальций или циклические АМФ или ГМФ и др) или через открывание ионных каналов, регулируемых рецептором. Не исключено, что сократительные белки или их аналоги связаны или даже включены в состав трансдуцинов и ионных каналов, что составит предмет будущих научных поисков. Можно рекомендовать микроспоры в качестве клеточных моделей для исследования роли цитоскелета в хемосигнализации, используя в качестве показателя развитие микроспор.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе. М.: Наука, 1987. 282 c.

. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины. Пущино: Биологический Центр АН СССР. 1991. 192 с.

, , Трансдукция хемосигнала у пыльцы // Цитология. 1998. Т. 40. № 11.

С. 964-971.

, , Активные формы кислорода и люминесценция интактных клеток микроспор // Биофизика. 2003. Т. 48. № 2. С. 259-264.

, , Автофлуоресценция интактных спор хвоща Equisetum arvense L. в процессе их развития // Биофизика. 2002. Т. 47. № 2. С. 318-324.

, , Активные формы кислорода и люминесценция интактных клеток микроспор // Биофизика. 2003. Т. 48. № 2. С. 259-264.

Bhattacharyya B., Howard R., Maity S. N., Brossi A, Sharma P N. and Wolff J. B ring regulation of colchicine binding kinetics and fluorescence // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1986. Т. 83. № 7. P. 2052–2055.

Cai G., S. Romagnoli S., Moscatelli A., Ovidi E., Gambellini G., Tiezzi A., Cresti M. Identification and Characterization of a Novel Microtubule-Based Motor Associated with Membranous Organelles in Tobacco Pollen Tubes // Plant Cell. 2000. V. 12. № 9. P. 1719–1736.

Chen B. T., Avshalumov M. V., Rice M. E. H 2O2 is a novel, endogenous modulator of synaptic dopamine release // J. Neurophysiol. 2001. V. 85. P. 2468–2476.

Chen C. Y., Wong E. I., Vidali L., Estavillo A., Hepler P. K., Hen-ming Wu, Cheung A. Y. The Regulation of Actin Organization by Actin-Depolymerizing Factor in Elongating Pollen Tubes // The Plant Cell. 2001. V. 14. P. 2175-2190.

Knight A. E., Kendrick-Jones J. A. Myosin-Like Protein From a Higher Plant // J. Mol. Biol. 1993. V. 231. № 1. P. 148-154.

Kuroda K., Kamiya N. Active movement of Nitella chloroplasts in vitro // Proc. Japan Acad. 1975. V. 51. № 10. P. 774-777.

McCurdy D. W., Williamson R. E. An actin-related protein inside pea chloroplasts // J. Cell Sci. 1987. V. 87. Iss. 3. P. 449-456.

Ren H., Gibbon B. C., Ashworth S. L., Sherman D. M., Yuan M., Staiger C. Actin purified from maize pollen functions in living plant cells // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1445-1457.

Roshchina V. V. Biomediators in chloroplasts of higher plants. 4. Reception by photosynthetic membranes // Photosynthetica. 1990. V. 24. № 4. P. 539-549.

Roshchina V. V. Neurotransmitters in plant life. Enfield, Plymouth: Science Publ., 2001. 283 p.

Roshchina V. V. Сellular models to study the allelopathic mechanisms // Allelopathy J. 2004. V. 13. № 1. P. 3-16.

Roshchina V. V. Plant microspores as unicellular models for the study of relations between contractile components and chemosignaling // International Symposium Biological Motility, Pushchino, 23 May-1 June 2004, ONTI, Pushchino. 2004.P. 194-196.

Roshchina V. V., Roshchina V. D. Ozone and Plant Cell. Dordrecht.: Kluwer Acad. Publ. 2003. 232 p.

Schönbohm E., Meyer-Wegener J. Actin polymerization as an essential process in light - and dark-controlled chloroplast anchorage // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1989. Bd. 185. № 5/6. Р. 337-342.

Staiger C. J. Signaling to the actin cytoskeleton in plant // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. V. 51. P. 257-288.

Takagi S. Actin-based photo-orientation movement of chloroplasts in plant cells // J. Exp. Biol. 2003. V. 206. P. 1963-1969.

Taylor L. P., Hepler P. K. Pollen germination and tube growth // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 461-491.

Vidali L, McKenna S. T., Hepler P. K. Actin polymerization is essential for pollen tube growth // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. № 8. P. 2534-2545.

Wagner G., Haupt W., Laux A. Reversible inhibition of chloroplast movement by cytochalasin B in the green alga Mougeotia // Science. 1972. V. 176. P. 808-809.

Ying Fua, Guang Wua, Zhenbiao Yanga. Rop GTPase–dependent Dynamics of Tip-localized F-Actin Controls Tip Growth in Pollen Tubes // J. Cell Biology. 2001. V. 152. № 5. P. 1019-1032.