УДК 615. 276. 2/. 4. 015. 44
ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИММУНОСТИМУЛЯТОРОВ СРЕДИ ЗАМЕЩЕННЫХ МОНО - И БИЦИКЛИЧЕСКИХ ПИПЕРИДИНОВ
, к. б.н., доцент
Лаборатория экологической физиологии НИИ «Проблем биологии и биотехнологии» при Казахском национальном университете имени аль – Фараби, Алматы
Исследована группа соединений, би - и моноциклических производных пиперидина в виде комплексов с β-циклодекстрином под лабораторным шифром БИВ. Наиболее высокие результаты по стимулированию лейкопоэза, лимфопоэза, гуморального иммунитета показало соединение БИВ-3, лишь уступая соединению БИВ-4 в активации фагоцитоза полинуклеаров. Его химическая структура являясь аналогом другим соединениям, в то же время отличалась наличием гидантаиновой группировки.
В настоящее время предметом пристального внимания исследователей являются различные аспекты экологических взаимоотношений современного человека с факторами окружающей среды, в частности, с солями тяжелых металлов. Около 20 заболеваний являются следствием воздействия высоких концентраций солей тяжелых металлов на организм человека [1]. Раннее проведенные нами исследования показали, что в результате введения в организм солей тяжелых металлов у животных развиваются тяжелые иммунодепрессивные синдромы [2]. Целью данного исследования явилось изучить иммуностимулирующую активность новых синтетических соединений на фоне вторичного иммунодепрессивного синдрома, развившегося на фоне интоксикации организма ацетатом свинца.
Материалы и методы.
Материалом служили белые беспородные половозрелые крысы обоего пола массой 210 – 220 г, 240 особей. Все животные содержались в стандартных виварных условиях. Животных разделили на группы по 10 особей с введением исследуемых соединений: 1-ой – БИВ-1, 2 – ой – БИВ-2, 3 – ей – БИВ-3, 4 – ой – БИВ-4, 5 – ой – БИВ-5, 6 – ой – БИВ-7, 7 – ой - левамизол. Интоксикацию животных проводили путем перорального введения раствора ацетата свинца (растворитель дистиллированная вода) в дозе 10 мг/кг объемом 10 мл3 в течение 10 дней. Последующее лечение исследуемыми соединениями проводили в течение 3 дней путем внутримышечного введения соединений (растворитель физиологический раствор) в дозе 
от ЛД50 объемом 0, 5 мл3. Забор периферической крови осуществляли из хвостовой вены животных с начала проведения эксперимента и последующие 1, 7, 14 сутки наблюдения после введения соединений. Из крови делали мазки для подсчета лейкограммы крови. Мазки крови окрашивали по Романовскому-Гимза, подсчитывали на микроскопе SA3300С под иммерсией (увеличение 7х100) по 100 клеток на каждом мазке, затем относительное количество каждого типа клеток пересчитывали в абсолютное[7]. С помощью камеры Горяева по общепринятой методике определяли общий лейкоцитарный показатель. Кроме того, забор периферической крови проводили из орбитального синуса крыс на 14 сутки наблюдения под слабым эфирным наркозом, в объеме 1, 5 мл3 и немедленно гепаринизировали 25 ЕД/мл. По общепринятой методике получали лимфоцитарно – моноцитарную клеточную суспензию, путем наслаивания на градиент фиколла – верографина (1,5 мл фиколла на 3 мл разведенной крови). Для оценки субпопуляционного состава Т – лимфоцитов периферической крови использовали метод типирования мембранных молекул с помощью моноклональных антител ИКО 111(СД3+), ИКО 101(СД4+), ИКО 31(СД8+), ИКО 180(СД20+), ИКО 105(СД25+) (НПЦ МедБиоСпектр, Москва)[2]. Результаты реакции СД – типирования оценивали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ при увеличении 10х90. При этом в каждом препарате подсчитывали 300 клеток. Интактным животным давали очищенную воду. Острую токсичность новых соединений определяли по при внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам обоего пола и массой 18 – 23 грамм. Бласттрансформирующую активность оценивали с помощью метода бластной трансформации [6]. Фагоцитарную активность оценивали НСТ-реакцией [7].
При статистической обработке результатов исследований проводили сравнение выборок по критерию t Стьюдента. На исследование иммуностимулирующей активности были взяты соединения, производные пиперидина.
Результаты исследований.
1. Исследование острой токсичности новых синтетических соединений.
В целом все соединения исследуемого ряда проявили очень низкий уровень острой токсичности. Острая токсичность соединений БИВ – 4 и БИВ – 6 была ниже в 21, 2 раза, чем у левамизола. ЛД50 трех соединений БИВ – 1, БИВ – 2, БИВ – 7 лежала в диапазоне от 790 до 851 мг/кг массы тела животного, что характеризовало соединения как малотоксичные. Лишь один препарат БИВ - 5 проявил острую токсичность 396 мг/кг, однако и он был менее токсичен, чем левамизол в 8, 4 раза (таблица 1).
Таблица 1 - Острая токсичность соединений
№ | Шифр соединения | Показатель острой токсичности (ЛД50 ), мг / кг | Показатель острой токсичности (ЛД50 ) относительно стандартного соединения левамизола. |
1 | Левамизол | 47, 24 + 0, 71 | 1 |
2 | БИВ – 1 | 851, 138 + 1, 38* | 18, 0 |
3 | БИВ – 2 | 787, 045 + 8, 38 | 16, 7 |
4 | БИВ – 3 | 446, 68 + 3, 24* | 9, 5 |
5 | БИВ – 4 | > 1000 мг/кг | 21, 2 |
6 | БИВ – 5 | 396, 278 + 3, 28* | 8, 4 |
7 | БИВ – 7 | 790, 678 + 8, 74 | 16, 7 |
*p<0,01
2 Показатели иммуностимулирующей активности новых синтетических соединений.
После проведенной интоксикации у животных наблюдалось нарушение психомоторных реакций, аппетита, слезоточивость глаз, внезапная гиперреактивность и агрессивность. Анализ крови показал лейкопению на фоне нейтрофилеза, лимфопении и моноцитопении. Достоверное снижение общего лейкоцитарного показвателя по сравнению с нормой произошло в 4, 2 раза. Наблюдался сдвиг лейкоцитарной формулы влево: выход метамиелоцитов и миелоцитов до 12%, резкое увеличение палочкоядерных нейтрофилов до 18%, снижение лимфоцитарного показателя до 24,1%. Кроме того, нейтрофилы характеризовались гиперсегментированностью ядер и токсической зернистостью. Была замечена базофильная токсическая зернистость в эритроцитах. На фоне лимфопении уровень Т – и В – лимфоцитов значительно снизился. Практически к нулевому показателю приблизились показатели Т – хелперов, Т – супрессоров/Т – киллеров. Все показатели крови говорили о сильной интоксикации организма и о приобретенном иммунодепрессивном синдроме. Фагоцитарная активность в соответствии с НСТ – показателем и индексом адгезии упала до 5%. Также наблюдалось почти полное отсутствие реакции бластообразования. Таким образом, на 10 день интоксикации ацетатом свинца у животных наблюдался выраженный иммунодепрессивный синдром. Получив выраженное иммунодефицитное состояние животных пролечили новыми исследуемыми соединениями.
По влиянию на лейкопоэз наиболее высокую активность проявило соединение БИВ – 3, оно на 14 сутки наблюдения увеличивало общий лейкоцитарный показатель, по сравнению с группой плацебо в 3, 8 раза и превосходило по активности левамизол в 3, 1 раза (Рис.1).. Лейкоцитарный показатель и показатели лейкоцитарной формулы практически приблизились к показателям здорового организма. Количество метамиелоцитов снизилось до 0,9%, миелоцитов до 2,9%, палочкоядерных нейтрофилов до 8,4%. Следующим по силе влияния на пролиферацию иммунных клеток было соединение БИВ – 7. Оно уступало по активности соединению БИВ – 3, но было активнее, чем все последующие соединения и препарат сравнения в 1, 5 раза.
После проведенного лечения на 14 сутки наблюдения соединение БИВ – 7 повысило общий показатель лейкоцитов в 1, 9 раза по сравнению с группой введения плацебо. Аналогично, как и после лечения предыдущим соединением в периферической крови наблюдалось незначительное количество миелоцитов и метамиелоцитов. Показатели лимфоцитов, эозинофилов, базофилов и моноцитов вернулись к нормальным показателям. Активность, сопоставимую с активностью левамизола проявили соединения БИВ–1, БИВ–4, БИВ–5. Не проявило иммуностимулирующей активности соединение БИВ–2. Животные погибли на 14–32 сутки после начала лечения исследуемым соединением.
В отношении лимфопоэза после проведенного лечения исследуемыми соединениями и левамизолом наиболее высокие результаты на 14 сутки наблюдались в группе лечения соединением БИВ – 3. Оно увеличивало количество Т – и В – лимфоцитов в 1, 7 и 1, 2 раза активнее, чем левамизол. Увеличилась популяция Т–хелперов и Т–супрессоров. Но, если посмотреть на активность соединений по влиянию в отдельности на каждую субпопуляцию лимфоцитов, то соединения БИВ–4, БИВ–7 проявили избирательное высокостимулирующее действие на пролиферацию Т–лимфоцитов и превосходили препарат сравнения в 1, 6 раза (рис. 2). У соединений БИВ-4 и БИВ-7 количество Т–хелперов было выше, чем у левамизола в 1, 3 и 1, 6 раза соответственно. Основываясь на количественных показателях лимфоцитов был подсчитан иммунорегуляторный индекс соединений. Наиболее высокий иммунорегуляторный индекс был у соединений БИВ–4 и БИВ–7, который превосходил препарат сравнения в 1,4 раза. Иммунорегуляторный индекс наравне с левамизолом был у соединения БИВ – 1.
Данные НСТ-теста коррелировали с показателями индекса адгезии (Рис. 3). Фагоцитоз полинуклеаров наиболее активно стимулировало соединение БИВ-4, превосходя левамизол в 3, 5 раза. Слегка превосходили препарат сравнения соединения БИВ-5, БИВ-7 (рис.3).
Новые синтетики также стимулировали процесс бласттрансформации у лимфоцитов в крови крыс (рис. 3). Наиболее высокой бласттрансформирующей активностью обладали соединения БИВ – 3, БИВ – 4, превосходя препарат сравнения в 1, 2 раза. Соединение БИВ – 7 проявляло сопоставимую с левамизолом активность.
Таким образом, исследуемые соединения в целом проявили очень низкий показатель острой токсичности. Наиболее активные соединения БИВ – 3 и БИВ – 7 обладали низким уровнем токсичности и были менее токсичны в 9, 5 и 16, 7 раза. Первичный фармакологический скрининг на иммуностимулирующую активность показал, что отличительно высокой активностью обладает соединение БИВ – 3. Его химическая структура являясь аналогом другим соединениям, в то же время отличалась наличием гидантаиновой группировки. БИВ-3 к 14 дню наблюдения восстановил общий лейкоцитарный показатель до уровня интактных животных. По влиянию на лимфопоэз оно проявляло высокую активность, стимулируя лимфопоэз Т –хелперов и Т – киллеров. Но по стимулированию фагоцитарной активности полинуклеаров БИВ – 3 уступал БИВ – 4.
Литература.
1. Гигиена. Под общей редакцией академика РАМН . Учебник для вузов. М.: ГЭОТАР – МЕД, 2001.
2. , , Гумарова солей тяжелых металлов на картину периферической крови крыс. // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2006. - №3 (29), с. 36-41.
3. Харкевич . Учебник для вузов. М.: ГЭОТАР – МЕД, 2002.
4. , , Иванова иммуномодулятора полиоксидония на восстановление костного мозга, поврежденного действием гидрокортизона и циклофосфана. – Иммунология, 2005, №6, т.26, С. 365 – 368.
5. Ю моно - и бициклические пиперидины: синтез, превращения и свойства. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук, Алматы, 2006.
6. , , Зубахин выделения клеток крови для одновременной постановки реакций торможения миграции лейкоцитов, розеткообразования и бластной трансформации. – Лабораторное дело, 1982, №2, С. 110 – 111.
7. , , Зебрев изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фармакол. Комитета. – 1999. - № 1. – С. 31 – 36.
8. Давыдова показатели крови и мочи у рабочих свинцово – цинкового производства. – Гигиена труда и профессиональных заболеваний, 1991, №8,С.32 – 34.
