Исследования биоактивных пептидов из некоторых видов растений

УДК 547.96:577.15

ИССЛЕДОВАНИЯ БИОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

, ,

, ,

а) Институт биоорганической химии им. акад. АН РУз

Ташкент, 100125 ул. Мирзо-Улугбека 83, факс 10- (998–71) 262-70-63,

e-mail: joshepkova05@rambler. ru

б) ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия»

Россия, Пятигорск, 357500, пр. Калинина, 11; факс [phone],

e-mail: [e-mail]

Из семян зиры, перца, кунжута и чернушки кислотной экстракцией были получены суммы пептидов, разделенных далее методами иоинообменной хроматографии. Определена цитотоксичность и фунгитоксичность полученных фракций.,.

Ключевые слова: перец овощной Capsicum annuum, седана Nigella sativa, кунжут Sesamum indicum, зира Cuminum cyminum, семена

Среди широкого спектра биоактивных соединений особое внимание исследователей привлекают пептиды, которые относятся к одному из наиболее перспективных классов низкомолекулярных биорегуляторов. К настоящему времени из природных источников выделено несколько тысяч пептидов. Часть из них является компонентами природной иммунной системы, развитой в течение миллионов лет эволюции, как результат взаимодействия «хозяев» и их патогенов.

Биоактивные пептиды обнаружены в семенах ряда растений, но число детально охарактеризованных пептидовеще невелико. В то же время показано, что катионные пептиды, содержащие в своей структуре цистеиновые группировки, проявляют высокие защитные свойства против различных групп инфекционных агентов [1,2]. Такие пептиды могут послужить альтернативой антибиотикам, к которым у ряда патогенов выработалась резистентность. Ранее нами было показано, что компоненты семян растений Apiaceae и Malvaceae - пептиды и эфирные масла обладают выраженной антимикробной активностью [3-5].

В связи с этим нами проведено выделение пептидов из семян перца овощного Capsicum annuum, чернушкаNigella sativa, кунжута Sesamum indicum, зиры Cuminum cyminum.

На первоначальном этапе исследовалась эффективность экстракции катионных пептидов из семян различными минеральными и органическими кислотами, 60%-ным водным ацетоном, буферами с различной ионной силой. Установлено, что наибольшая полнота извлечения пептидов из измельченных и обезжиренных семян достигалась 0.05 М уксусной кислотой, в то же время при использовании минеральных кислот происходила частичная деструкция пептидов, а при экстракции ацетоном и буферами не достигалась полнота выделения.

Полученные экстракты нейтрализовали NaOH, центрифугировали и супернатант лиофильно высушивали. Далее экстракты были дважды диализованы против воды и буфера трис-HCl, рН 9.0. Затем экстракты были последовательно разделены методом ионообменной хроматографии на колонках DEAE-Servacel и CM-TSK в ступенчатом градиенте NaCl в аммоний ацетатном буфере рН 6.0 (0-0.5М) .

Содержание пептидов в полученных фракциях анализировали электрофоретическим методом, который показал наличие пептидов с молекулярной массой порядка 2-10 кДa (рис.1-4). Исходя из литературных данных и результатов собственных исследований [6,7}, можно предположит, что пептиды с молекулярной массой 2-5 кДа относятся к классу дефензинов, а с М. м около 10 кДа – к так называемым липидпереносящим белкам.

Биологическую активность экстрактов семян и фракций, полученных после разделения на СМ-ТSК геле, проверяли в тестах на фунгитоксичность на культуре патогенных штаммов № 108 гриба Verticillium dahliae и цитотоксичность на клетках меланомы мышей КМЛ в культуре тканей, которая оценивалась по включению Н3-тимидина в ДНК опухолевых клеток. (таблица).

Таблица

Биологическая активность экстрактов семян перца овощного Capsicum annuum, чернушка Nigella sativa, кунжута Sesamum indicum, зиры Cuminum cyminum и наиболее активных фракций

Фракции	Фунгитоксичность IC50 µg/ml	Цитотоксичность % подавления включения Н3-тимидина
Экстракт перца овощного	79	33,0
Фракция П-1	70	10,9
Экстракт кунжута	60	2,6
Фракции К-2	37
Фракция К-3	30
Фракция К-4	39
Экстракт зиры	64	1,0
Экстракт чернушки	65	95,0
Фракция С-1	41	39,5
Фракция С-2	58	96,3
Фракция С-3	18	42,9

IC50 – концетрация пептидов, вызывающих 50 % подавление роста гриба

Как следует из полученных данных, наибольшей биологической активностью обладает экстракт чернушки, содержащий сумму катионных пептидов, и его отдельные компоненты, полученные методом ионообменной хроматографии. Выраженная цитотоксическая активность пептидов чернушки делает их перспективными для дальнейшего углубленного изучения их противоопухолевой активности на различных видах опухолей в тестах как и in vitro, так и in vivo. Кроме того, пептиды с высокой фунгитоксичностью, выделенные в дальнейшем в индивидуальном виде, могут послужить маркерами генов , используемых в качестве биотехнологических инструментов при генетической инженерии сельскохозяйственных растений, резистентных к действию грибных и микробных патогенов.

Экспериментальная часть

Выделение и очистка пептидов из семян . 50 г семян измельчали и обезжиривали в течение 72 ч гексаном в аппарате Сокслета. Пептиды экстрагировали из обезжиренных семян 200 мл 0.05 М уксусной кислоты в течение 3 часов при 30oC. После удаления нерастворимой части семян центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15мин, супернатант нейтрализовали 1 н. NaOH и выдерживали при 5оС в течение 12 часов до полного осаждения глобулинов, центрифугированием удаляли выпавший осадок. Супернатант диализовали и лиофильно высушивали супернатант.

Ионообменная хроматография. Диализованный экстракт доводили до рН 9 0.05М ацетатом аммония и пропускали через колонку Servacel DEAE-23SN (2.0х 10см, Reanal), уравновешенную 0.05 М ацетатом аммония (рН 9) при скорости потока 0.5 мл/мин. Фракции, не связывающихся с сорбентом белков представляют собой основные термостабильные белки семян растений. Полученный элюат доводили до рН 6 уксусной кислотой и наносили на колонку CM-TSK - 650M (2.0х5 см Tosoh Bioscience), уравновешенную 0.05 М ацетатом аммония (рН 6). Связанные c сорбентом белки элюировали 200 мл линейного градиента от 0 М до 0.5 М NaCl в 0.05 М ацетате аммония (рН 6) при скорости потока 0.5 мл/мин. Детекция белков осуществлялась при 280 нм. Полученные пептидные фракции после диализа лиофильно высушивали и использовали для дальнейшей очистки.

Электрофоретический анализ белков. Электрофоретический анализ белков проводили по Леммли [8], используя 15% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, рН 8.9.

Анализ фунгитоксичности. Фунгитоксичность на всех этапах выделения биоцидных пептидов определяли турбидиметрическим микропланшетным методом [9]. Микропланшеты инкубировали при 27oС в течение 48 часов, и рост грибов оценивали по измерению оптического поглощения при 490 нм, используя автоматический микропланшетный ридер Model 3550 (Bio-Rad). Анализ проводился в 3-х кратной повторности.

Цитотоксическая активность. Культуру клеток КМЛ получали из штамма меланомы мышей. Клетки рассеивали во флаконы по 4х104 клеток\мл в 3 мл питательной среды RPMi -1640 с 10% сыворотки эмбриона теленка, 200 мМ глутамина, антибиотиками и культивировали в термостате при 37оС. Через 24 ч вводили исследуемые фракции в концентрации 100мкг/мл. Экспозиция составляла 24 ч. Затем на 1 ч добавляли Н3-тимидин (370 Бк/флакон. Метку удаляли со средой и добавляли 1 мл 0,2% раствора версена на 3-5 минут для снятия клеток со стекла. Суспензию клеток переносили на GFC-фильтры, фиксировали и промывали 5 % раствором ТХУ (3х10 мин), дистиллированной водой (3х10 мин), высушивали.

Цитотоксическое действие исследуемых фракций оценивали по интенсивности включения Н3-тимидина в ДНК клеток на жидкостном сцинтилляционном счетчике Бета-1 в ЖС-106. Полученные результаты выражали в % от контроля по подавлении. Включения метки. Повторность эксперимента трехкратная. Контроль – клетки без воздействия исследуемых фракций.

Литература

Johansson S., Gullbo J., Lindholm P., Ek B., Thunberg E., Samuelsson G., Larsson R., Bohlin L., Claeson P. //Cell. Mol. Life Sci., 60, 165. (2003) H. Wang, T. B. Ng, Peptides, 25, 1209 (2004) 3.. A. Yili, H. Yimamu, B. B. Максимов, H. Aisa, , ., ХПС, 394. (2006) А. Yili, H. A. Aisa, Х. Imamu, , .. ХПС, 451. (2006) , , .// Химия природных соединений. 66 (2005 ). , , Биоорганичечкая химия, 35,1 (2009) Milbradt A. G., Kerek F., Moroder L., Renner C. Structural characterization of hellethionins from Helleborus purpurascens// Biochem., 42, 2404 (2003). U. K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970) M. S. Almeida, K. S. Cabral, R. B. Zingali, and E. Kurtenbach, Arch. Biochem. Biophys., 378, 278 (2000).

kДa 97 68 29 12.4

1 2 3 4 5 6

 

Рис. 1. Гель-электрофорез в 10-15% ПААГ: 1 - цитохром-12.4 кДa; 2-смесь маркеров: фосфорилаза В 97 кДa, альбумин 68 кДa, карбонангидраза 29 кДa; 3 – экстракт перца овощного Capsicum annuum,; 4 – 1 фракция после CM-TSK; 5 – 2 фракция после CM-TSK; 6 – 3 фракция после CM-TSK

кДa 116 97 68 14 12 8

1 2 3 4 5

 

Рис.2 Гель-электрофорез зиры Cuminum cyminum в градиенте 10-15% ПААГ: 1 – смесь маркеров: миоглобин I+II-14 кДa, миоглобин I+III-12 кДa, миоглобин II-8 кДa; 2 – экстракт семян зиры Cuminum cyminum; 3 – фракция после CM-TSK; 4 – цитохром-12 кДa; 5 – смесь маркеров: β-галактозидаза-116 кДa, фосфорилаза В-97 кДa, альбумин-68 кДa.

1 2 3 4 5 6

 

Рис.3 Электрофоретический анализ фракций семян кунжута в ПААГ: 1- смесь белков-маркеров: карбонангидраза 29 кДa, цитохром С 12.4 кДa; 2 – экстракт семян кунжута Sesamum; 3 – фракция I после CM-TSK; 4 – фракция II после CM-TSK; 5 – фракция III после CM-TSK; 6 – фракция IV после CM-TSK.

1 2 3 4 5 6 7

kДa 48 29 18 12 5.8

Рис.4 Электрофорез в градиенте 10-15% ПААГ фракций семян седаны Nigella sativa: 1,7 – цитохром 12 кДa, инсулин 8.5 кДa, 2 – экстракт семян седаны, 3 –фракция I после ионообменной хроматографии на CM-TSK; 4 –фракция II после CM-TSK; 5 –фракция III после CM-TSK; 6 – смесь маркеров: фумараза 48 кДa, карбонангидраза 29 кДa, β-лактоглобулин 18 кДa, цитохром 12.4 кДa.