БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.113:004:63
промоторы генов транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов цитокинов в макрофаге, содержат потенциальные сайты связывания арил-гиДрокарбонового рецептора
1,2, 1, 1, 1, 3, 1
В связи с интенсивным техногенным воздействием на биосферу и обусловленным этим увеличением содержания в окружающей среде токсичных ксенобиотиков различной природы, в частности, ПАУ (полиароматических углеводородов) и диоксинов, все большую актуальность приобретают исследования, касающиеся характера вызываемых ими эффектов, механизмов их воздействия и метаболизма в живых организмах и, прежде всего, организма человека. В группу ПАУ входят десятки веществ, для которых характерно наличие в химической структуре трех и более конденсированных бензольных колец. Группа диоксинов объединяет сотни соединений, содержащих в своем составе специфическую гетероциклическую структуру с атомами хлора в качестве заместителей. Среди ксенобиотиков-соединений диоксинового ряда наиболее токсичным является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин или, сокращенно — 2,3,7,8-ТХДД (TCDD) [1,2] .
Показано, что на уровне организма диоксин вызывает широкий спектр системных эффектов, среди которых и воздействие на иммунную систему, в том числе и на клеточный иммунитет. Одним из элементов, участвующих в клеточном иммунном ответе, являются макрофаги. Известно, что на воздействие диоксина клетка отвечает изменением уровня экспрессии значительного числа генов, причем характер ответной реакции является видо - и тканеспецифичным [3-6]. Опубликованы результаты многочисленных экспериментов, выполненных на разных видах организмов, типах клеток, in vivo и in vitro, однако набор генов, вовлекаемых в ответ макрофага на диоксин, и механизмы их активации исследованы недостаточно.
С использованием биоинформатического метода SITECON нами исследованы регуляторные районы генов транскрипционных факторов, экспрессирующихся в активированном макрофаге, и генов факторов, опосредующих участие макрофага в иммунном ответе. В структуре этих районов у генов обоих типов выявлены специфические сайты (DRE), ответственные за реакцию на диоксин. Анализ регуляторных районов генов, формирующих иммунный ответ, показывает, что при воздействии диоксина их экспрессия может регулироваться двояким образом: транскрипционным фактором, содержащим в своем составе диоксин в качестве лиганда, и имманентными транскрипционными факторами.
Действие диоксина, как и многих других ксенобиотиков, на внутриклеточные процессы у позвоночных опосредуется арилгидрокарбоновым рецептором (AHR). AHR является лиганд-активируемым транскрипционным фактором из семейства bHLH/PAS, который регулирует транскрипцию генов, содержащих в структуре 5’ районов опознаваемые этим фактором специфические сайты - т. н. dioxin responsive elements (DRE). (Для их обозначения используется также аббревиатура XRE или AHRE [5]). Одним из экзогенных лигандов для AHR является диоксин. В отсутствие лиганда AhR находится в цитоплазме клетки в комплексе с шапероновым белком Hsp90 и белками-кошаперонами p23 и иммунофилин-подобным белком XAP2 (известным также как ARA9 или AIP). После связывания с лигандом комплекс перемещается в ядро и диссоциирует [7-8]. Оставшийся связанным с лигандом AHR димеризуется с белком ARNT (AhR Nuclear Translocator), который также принадлежит к семейству bHLH. Комплекс лиганд-AHR-ARNT функционирует как транскрипционный фактор, связываясь с последовательностями DRE в регуляторных районах генов-мишеней [5, 9]. Коровой консенсусной последовательностью DRE является 5’-GCGTG-3’ [5]. При этом AHR контактирует с 5’-TNGC, а ARNT – с GTG-3’ полусайтами консенсусной последовательности [3]. Роль лиганда в этом комплексе пока не ясна.
При воздействии диоксина изменение экспрессии генов может происходить как вследствие прямого взаимодействия рецепторного комплекса с DRE в их регуляторных районах, так и опосредованно – по механизму каскадной регуляции через цепочку взаимодействующих генов с участием генов транскрипционных факторов.
Возможность прямой регуляции экспрессии показана экспериментально для целого ряда генов макрофага, экспрессирующихся в ответ на диоксин. Однако вклад транскрипционных факторов в ответе макрофага на диоксин изучен слабо.
В настоящее время, наряду с экспериментальными, все большее распространение получают биоинформатические методы выявления DRE в структуре генов. В основном эти методы базируются на контекстном анализе первичных последовательностей ДНК. В частности, с использованием метода весовых матриц потенциальные DRE были выявлены в структуре 48 из 2437 ортологичных генов, подвергнутых анализу [3].
Для поиска DRE в регуляторных районах генов нами использован метод SITECON [10]. Метод основан на выявлении консервативных контекстно-зависимых конформационных и физико-химических свойств, определенных для набора коротких фрагментов последовательностей сайтов ДНК, опознаваемых факторами транскрипции, и последующего сравнения выявленных консервативных свойств со свойствами анализируемой последовательности. Для обучения была использована выборка bona fide DRE, включающая 13 последовательностей [3]. Критерием принадлежности тестируемой последовательности к DRE функциональным сайтам является уровень ее конформационного сходства с последовательностями обучающей выборки при заданном значении ошибки распознавания. Для идентификации сайтов DRE был выбран уровень сходства P=0.95 при котором ошибка I-го рода (недопредсказание) равна нулю.
Cравнение результатов использования SITECON для поиска сайтов DRE с методом весовых матриц показало более высокую эффективность SITECON [11]. Высокая предсказательная способность метода SITECON метода получила и экспериментальное подтверждение при проверке связывания транскрипционных факторов SF-1 и SREBP с предсказанными потенциальными сайтами связывания [12].
Результаты распознавания суммированы в табл. 1.
Таблица 1. Сайты DRE в генах транскрипционных факторов, экспрессирующихся в активированном макрофаге
Короткое название гена | Полное название/синоним | Позиция сайта | Уровень сходства (P) | Нуклеотидная последовательность потенциального DRE сайта |
CEBPb | C/EBPβ (CCAAT/ enhancer binding protein) NF-IL6 | -68 -217 | 0.968 0.966 | GGCCGGCGTGACGC AGGGGGCGTGAGGC |
NFkB1 | nuclear factor-kB1 p50/ p105 | -65 | 0.985 | CCGCTGCGTGCGCG |
NFkB2 | nuclear factor-kB2 p49/ p100/ p52 | -132 | 0.967 | GCGAGGCGTGACGC |
RelA | p65/ NFkB3 | -110 -137 -199 | 0.970 0.987 0.972 | GCGCGGCGTGCACT GCTGTGCGTGCAGC GGCTGGCGTGCCCG |
RelB | I-Rel/ v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B | -100 -249 | 0.968 0.967 | CCCAGGCGTGACGT GTAAGGCGTGATGG |
c-Rel | c-Rel proto-oncogene | -207 -346 | 0.975 0.974 | GGGGAGCGTGCGCG TAGCAGCGTGAGAA |
JUN | Proto-oncogene c-jun | -180 | 0.970 | GAGAGGCGTGCGGC |
IRF1 | Interferon regulatory factor 1 | -145 | 0.985 | CGGCTGCGTGCCGT |
IRF4 | Interferon regulatory factor 4 | -172 | 0.968 | GGCCGGCGTGAAGG |
STAT3 | Signal Transducer and Activator of Transcription 3 | -57 -349 -586 | 0.970 0.984 0.983 | TGACGGCGTGCCTC GCAGTGCGTGACGT TTTCTGCGTGAGCA |
Показателями, позволяющими оценить выявленные сайты как потенциально активные DRE, являлись их позиция и высокий уровень сходства по критерию SITECON.
Такие сайты обнаружены в промоторных районах десяти из тринадцати генов транскрипционных факторов, функционирующих в активированном макрофаге. Выявлено по три таких сайта для генов NFkB3 и STAT3, по два для CEBPb и RelB и по одному для NFkB1, NFkB2, JUN, IRF1и IRF4 (табл. 1).
Одиночные DRE в промоторах во всех случаях расположены не далее, чем за 200 оснований от старта транскрипции (в положении -65, -135, -180, -145, -172 для NFkB1, NFkB2, JUN, IRF1 и IRF4 соответственно).
В промоторах обоих генов CEBPb и RelB пары DRE разделены всего 135 основаниями.
Два из трех DRE в промоторе STAT3 расположены на более значительном расстоянии от старта, чем сайты в промоторах других генов – в позициях -349 и -586, зато третий DRE найден на минимальном расстоянии – в позиции -57.
В промоторе NFkB3 три DRE расположены на участке длиной около девяноста оснований. Полагают, что наличие нескольких, в особенности тандемно расположенных функциональных DRE сайтов в составе регуляторного района могут за счет кооперативного эффекта обеспечивать реактивность соответствующего гена на более низкие концентрации комплекса лиганд-ксенобиотик и возможность более тонкой регуляции его активности [9].
Присутствующая нуклеотидная гетерогенность DRE может создавать более широкое разнообразие вариантов ответа на комплекс ксенобиотик-лиганд за счет разной афинности к комплексу сайтов различного состава [13-14].
Кроме указанных в табл. 1, потенциальные сайты DRE на более значительных расстояниях выше старта транскрипции, а также ниже позиции старта были обнаружены как в регуляторных районах генов, перечисленных в табл.1, так и генов IRF2, IRF7, STAT1α, не включенных в нее (данные не приведены). Учитывая, что DRE обладают свойствами энхансеров [14], эти элементы также могут оказаться функционально активными.
Одной из важнейших функций макрофага является выработка различных регуляторных факторов, участвующих в формировании иммунных реакций организма. Установлено, что экспрессия многих генов, кодирующих секретируемые макрофагом регуляторные белки или ферменты, участвующие в синтезе простагландинов, регулируются транскрипционными факторами, поименованными в табл. 1.
В табл. 2 приведен список генов, участвующих в формировании иммунного ответа, и транскрипционных факторов, регулирующих их активность. Экспрессия почти всех этих генов контролируется транскрипционным фактором NFkB (nuclear factor kappa B). Этому фактору принадлежит основная роль внутриклеточного медиатора разнообразных внешних воздействий в некоторых типах клеток, в том числе, макрофагах, где он инициирует запуск механизма системы неспецифического иммунного ответа через активацию экспрессии ряда генов ферментов, провоспалительных цитокинов (IFNα, β, IL-1, IL-6 и IL-8, TNFα), хемокинов (MCP-1, MIP-1, RANTES).
Таблица 2. Гены цитокинов и других факторов, участвующих в формировании иммунного ответа, содержащие в структуре регуляторных районов DRE, и транскрипционные факторы, регулирующие их активность.
Короткое название гена | Полное название и функция продукта | Транскрипционный фактор |
COX-2 | Cyclooxygenase 2, фермент | NFkB, C/EBPb, JUN |
IFNA | Interferon alpha, интерферон | IRF1 |
IFNB | Interferon beta, интерферон | NFkB, IRF1 |
IFN-γ | Interferon gamma, интерферон | NFkB |
IL1B | Interleukin 1 beta, монокин | NFkB, C/EBPb, IRF4 |
IL-6 | interleukin 6, лимфокин | NFkB, C/EBPb |
IL-8 | interleukin 8, хемокин | NFkB, C/EBPb |
IL12A | Interleukin-12A, монокин | NFkB, IRF1, C/EBPb |
IL12B | interleukin 12B, монокин | NFkB, IRF1 |
MCP-1 | macrophage chemotactic protein-1, хемокин | NFkB |
MIP1a | macrophage inflammatory protein 1 alpha, провоспалительный хемокин | NFkB, C/EBPb |
MIP1b | macrophage inflammatory protein 1 beta, провоспалительный хемокин | NFkB |
RANTES | Regulated on Activation, Normal T - lymphocyte Expressed and Secreted, хемокин | NFkB, IRF1, JUN, C/EBPb |
TNF-a | Tumor necrosis factor alpha, провоспалительный цитокин | NFkB, C/EBPb, JUN |
Следует отметить, что, согласно литературным данным, экспрессия гена одного и того же цитокина в большинстве случаев регулируется несколькими транскрипционными факторами, что увеличивает реактивность системы ответа, создавая возможность синергичного эффекта при их сочетанном действии [15].
Значительная часть из списка генов, приведенных в табл.2, регулируется комплексом транскрипционных факторов, располагающих в структуре своих промоторных районов. По нашим данным, некоторые из названных генов также обладают DRE. Так, в регуляторных областях генов Il12A и Il12B DRE выявлены на расстоянии -612 и -598 от старта транскрипции соответственно (данные не опубл.). Таким образом, создается возможность двойного контроля активности цитокиновых генов с каскадной регуляцией интегрированного ответа макрофага на ксенобиотик.
Вероятно, что механизмы ответа макрофага на ксенобиотик и на факторы, активирующие формирование реакций иммунного ответа, тесно связаны. Так, например, на ранних стадиях инфекционного заболевания макрофаги секретируют провоспалительные цитокины: интерлейкины–1, 2, 6, 12 и фактор некроза опухоли (TNF-a), а также хемокины. Но экспрессия одноименных генов может стимулироваться и воздействием диоксина.
Все приведенные в табл.1 гены транскрипционных факторов не только содержат в составе своих регуляторных районов DRE, что обеспечивает возможность прямого ответа на воздействие ПАУ, но и являются важнейшими компонентами, участвующими в выполнении макрофагами их основной функции – осуществлении иммунного ответа.
Логично предположить, что система реакции на ксенобиотик организована по иерархическому принципу. Роль иммунотропного пускового звена в этой системе отводится ксенобиотику. В комплексе с AhR ксенобиотик контролирует экспрессию DRE-содержащих генов транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов цитокинов и других белков, обеспечивающих как неспецифический иммунный ответ, так и/или иммунную реакцию специфического типа.
Поскольку гены, задействованные в реализации иммунного ответа, располагают и DRE, принципиально возможно и одновременное, а не последовательное, выполнение этих процессов. Таким образом, ксенобиотик способен активировать и/ или модифицировать иммунный ответ организма, подвергшегося его воздействию.
Наличие двойной регуляции – через DRE и сайты связывания соответствующих транскрипционных факторов, а также отношения взаимной регуляции между генами, входящими в систему обеспечения иммунного ответа, создают возможность быстрой реакции системы на провоцирующий агент (ксенобиотик) и точную подстройку ее функционирования.
Работа поддержана проектами “Компьютерное моделирование и экспериментальное конструирование генных сетей” по Программе фундаментальных исследований РАН “Молекулярная и клеточная биология” и интеграционным проектом СО РАН “Эволюция молекулярно-генетических систем: компьютерный анализ и моделирование” по Подпрограмме II Программы РАН “Происхождение и эволюция биосферы”.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Walker N. J., Portier C. J., Lax S. F., Crofts F. G., Li Y., Lucier G. W., Sutter T. R. // Toxicol Appl Pharmacol. 1999. V. 154(3). P. 279-286.
2. Zodrow J. M., Stegeman J. J., Tanguay R. L. // Aquat Toxicol.. 2004. V. 66. P. 25-38.
3. Sun Y. V., Boverho f D. R., Burgoon L. D., Fielden M. R., Zacharewski T. R. // Nucleic Acids Research. 2004. V. 32. No. 15. P. 4512–4523.
4. Connor K. T., .Aylward L. L. // Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 2006. V. 9. No. 2. P. 147-171.
5. Boutros P. C., Moffat I. D., Franc M. A., Tuomisto J., Okey A. B. // J. Bichem. Biphys. mun. 2004. P. 707-715.
6. Frericks M., Meissner M., Esser Ch. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007, doi:10.1016/j. taap.2007.01.014.
7. Kazlauskas A., Sundstrom S., Poellinger L., Pongratz I. // Mol Cell Biol. 2001. V. 21. P. 2594–2607.
8. Okey, A. B. // Toxicol. Sci. 2007. V. 98. P. 5–38
9. Fujita, H., Samejima, H., Kitagawa, N., Mitsuhashi, T., Washio, T., Yonemoto, J., Tomita, M., Takahashi, T., and Kosaki, K. // Cong. Anom. 2006. V. 46. P. 135–143.
10. Oshchepkov D. Y., Vityaev E. E., Grigorovich D. A., Ignatieva E. V., Khlebodarova T. M. // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32 (Web Server issue). W208-212.
11. Nedosekina EA, Oshchepkov DY, Katokhin AV, Kuznetsova TN, Shamanina MY, Mordvinov VA, Tsyrlov I. // Organohalogen Compounds. 2007.V. 69. P. 1889-1892.
12. Kolchanov N. A., Merkulova T. I., Ignatieva E. V., Ananko E. A., Oshchepkov D. Yu., Levitsky V. G., Vasiliev G. V., Klimova N. V., Merkulov V. M., Hodgman Ch. T. // Briefings in Bioinformatics. 2007. V.8. P. 266-274.
13. Lusska, A., Shen, E., and James, P. W., Jr. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 6575-6580.
14. Denison M. S., Fisher J. M., Whitlock J. P. Jr. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 2528-2532.
15. Baer, M., Williams, S. C., Dillner, A., Schwartz, R. C. and Johnson, P. F. // Blood. 1998. V. 92. P. 4353-4365.
1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д.10
2Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д.2
3Медицинская Школа Маунт Синай, Нью-Йорк, США
