Общая микробиология
УДК 579.2
Aнтибиотикорезистентность комменсальных Escherichia coli кишечной микробиоты больных Семейной Средиземноморской Лихорадкой
*,1, *, *, А. Григорян*, **, *, Е. Диланян**, И. Пицено***, Т. Торок***
*Армянский Национальный Аграрный Университет, Ереван, Армения
**Международная Ассоциация по Улучшению Здоровья Людей и Животных, Ереван, Армения
***Национальная Лаборатория Лоуренс Беркли, Беркли, США
1 Автор для корреспонденции (e-mail: *****@***ru)
Поступила в редакцию
В представленной работе с использованием клинического бактериологического анализа и ДНК-микрочипов высокой плотности (PhyloChipTM) исследовано качественное и количественное распространение кишечных Escherichia больных семейной средиземноморской лихорадкой. Обнаружено увеличение количества ОТЕ бактерий рода Escherichia в кишечной микробиоте этих больных. Изучение антибиотикорезистентности комменсальных E. coli выявило большой процент резистентных и мультирезистентных изолятов в кишечной микробиоте больных семейной средиземноморской лихорадкой.
Изучение влияния коммерческого пробиотика "Наринэ" (Витамакс-Е, Армения) на состав кишечной микробиоты ПБ больных показало, что пробиотикотерапия приводит к уменьшению количества ОТЕ кишечных Escherichia. Выявлено также, что после приема пробиотика количество мультирезистентных E. coli изолятов в группах Плацебо и "Наринэ" достоверно снижается. Механизм действия пробиотика "Наринэ" на обмен кишечных бактерии и на их антибиотикорезистентность обсуждается.
Ключевые слова: Семейная средиземноморская лихорадка, клинический бактериологический анализ, PhyloChipTM, Escherichia, антибиотикорезистентность, пробиотик.
Роль антимикробных препаратов в уменьшении заболеваемости и смертности от инфекционных заболеваний трудно переоценить. Тем не менее, чрезмерное и зачастую необоснованное использование антибиотиков привело к быстрому распространению антибиотикорезистентных комменсальных бактерий в различных экосистемах, в том числе и в кишечной микробиоте здоровых и больных людей [1-3].
Семейная средиземноморская лихорадка или Периодическая болезнь (ПБ), являясь наследственным заболеванием, вызванным мутацией гена MEFV (MIMno249100), встречается у народов Средиземноморского бассейна. В гетерозиготном состоянии носителем мутации данного гена является каждый седьмой представитель армянской нации [4, 5]. По имеющимся литературным данным мутации гена MEFV могут влиять на состав микробиоты кишечника больных ПБ [6]. Частыми являются также дисфункции кишечника у больных на фоне лечения колхицином.
С другой стороны, известно также, что E. coli часто используют для мониторинга антибиотикорезистентности по причине широкой распространенности этих бактерий у различных хозяев, а также тем, что они легко приобретают резистеннтные свойства и обмениваются ими с другими бактериями [7, 8].
Учитывая вышеприведенное, главной целью представленной работы явилось изучение антибиотикорезистентности E. coli ПБ больных. Мы также задались целью исследовать качественный и количественный состав кишечных предстaвителей рода Escherichia с использованием клинического бактериологического и PhyloChipTM анализа.
Материалы и Методы иccледования
В исследовании приняли участие 45 больных ПБ (15 женщин и 30 мужчин, средний возраст больных составлял 30.5 ± 12.6 лет) из клинической больницы № 8 города Еревана РА и 30 здоровых добровольцев (23 женщин и 7 мужчин, средний возраст 35.2 ± 11.4 лет). Никто из участников исследования не принимал антибиотики, гормоны и химиотерапевтические препараты по крайней мере в течении месяца до начала исследования. Больные ПБ продолжали принимать колхицин во время исследования в тех же дозах, что и до исследования.
Имели две группы больных и две здоровых. Первой группе назначали пробиотик "Наринэ" (Vitamax-E, Армения), второй – Плацебо. Все больные первой группы имели дисбактериоз кишечника по лактобациллам. Участники исследования принимали препараты по одной капсуле дважды в день в течении 30 дней.
Фекальный материал собирали трижды. Первый раз - до назначения "Наринэ" и Плацебо, второй раз - сразу после прекращения приема препарата и Плацебо, и третий раз - через 1.5 месяц после прекращения приема препарата и Плацебо. Культуральный анализ осуществлялся с использованием селективных и идентификационных на основе физиолого-биохимических признаков тестовых сред идентификации [9].
Для выделения фекальной ДНК использовали ZR Fecal DNA MiniPrep (ZYMO RESEARCH CORP.) и Ultra Clean Fecal DNA Isolation Kit (MOBIO Laboratories, Inc.). С помощью Phylochip™ бактериальные сообщества определялись на основе выделения операционных таксономических единиц (ОТЕ) [10].
Антибиотикорезистентность бактерии определяли дисковым методом, методом микроразведений и с помощью Vitek 2 Compact (bioMérieux, France) систем. Для определения антибиотикочувствительности бактерий использовались следующие антибиотики: тетрациклин 15 мкг/мл (Oxoid), доксициклин 15 мкг/мл (Biomerieux), амоксициллин 25 мкг/мл (Biomerieux), левомицетин 30 мкг/мл (Oxoid), ципрофлоксатин 5 мкг/мл (Krka) и цефазолин 15 мкг/мл (Biomerieux).
Штаммы E. coli ATCC 25922 и ATCC 35218, Enterococcus faecalis ATCC 29212 были использованы в качестве контрольных.
Статистическую обработку данных проводили используя програмное обеспечение Excel (Student t- test), а также программу Multibase 2013, вероятность P < 0.05 считали статистически значимой.
Pезультаты и обсуждение
Идентифицировано 157 ОТЕ принадлежащих роду Escherichia. Сравнительный анализ ОТЕ кишечных бактерий рода Escherichia больных ПБ и здоровых добровольцев представлен на рис. 1. По рис. 1 видно увеличение количества ОТЕ бактерий рода Escherichia в кишечной микробиоте изученных больных. С другой стороны, сравнительный культуральный бактериологический анализ показал, что увеличение количества ОТЕ у ПБ больных не оказывает существенное влияние на титры комменсальных E. coli. Согласно нашим экспериментальным данным, титры комменсальных E. coli у больных ПБ были в пределах нормы (табл. 1).
Исследования по профили антибиотикорезистентности комменсальных E. coli больных Семейной Средиземноморской Лихорадкой показали, что комменсальные изоляты E. coli этих больных имели высокую резистентность к антибиотикам группе тетрациклин (табл. 2).
Недавно внимание к пробиотикам в основном обращено по двум причинам: i.как "регуляторов" иммунологического статуса хозяина, и ii.как способа борьбы против устранения антибиотикорезистентности в экосистемах.
Пробиотик "Наринэ" (Витамакс-Е, Армения) один из часто назначаемых препаратов ПБ больным в Армении. В состав "Нарине" входит Lactobacillus acidophilus Er-2 317/402. Считается, что Lactobacillus acidophilus Er-2 317/402 нормализует микрофлору кишечника, способствует всасыванию витаминов и снижению уровня холестерина в сыворотке крови, а также увеличивает выработку интерферона [11].
Учитывая вышеприведенное, во второй этапе работы мы задались целью изучать влияние пробиотика "Наринэ" на состав кишечных E. coli ПБ больных. Результаты рис. 2. свидетельствуют, что пробиотикотерапия приводит к уменьшению количества ОТЕ кишечных E. coli у ПБ больных. Статистически достоверные изменения количеств ОТЕ после приема как Плацебо, так и "Нарине" у здоровых людей не наблюдались (рис. 3). Плацебо также не оказывает статистически достоверное влияние на количества ОТЕ кишечных E. coli у ПБ больных (результаты не приведены). Данные табл. 1 показывают, что количество кишечных комменсальных E. coli как до, так и после пробиотикотерапии находится в пределах нормы клинического бактериологического анализа.
Для мониторинга антибиотикорезистентности изолятов E. coli после приема пробиотика всего, в общей сложности, 749 комменсальных изолятов E. coli было протестировано на чувствительность к различным антибиотикам. Результаты представлены в табл. 2. Нами выявлено, что после приема пробиотика количество мультирезистентных изолятов в группах Плацебо и "Наринэ" достоверно снижалось.
Таким образом, нами выявлено большой процент резистентных и мультирезистентных изолятов комменсальных E. coli в кишечной микробиоте больных семейной средиземноморской лихорадкой на фоне увеличения количества ОТЕ бактерий рода Escherichia в кишечной микробиоте этих больных. Применение коммерческого пробиотика "Наринэ" (Витамакс-Е, Армения) приводит к уменьшению количества ОТЕ рода Escherichia. Весьма интересным является факт снижения количества мультирезистентных изолятов в группах Плацебо и "Наринэ" после приема пробиотика. Механизм действия пробиотика "Наринэ" на обмен кишечных комменсальных E. coli и на их антибиотикорезистентность обсуждается.
Работа выполнена в рамках проекта МНТЦ A-1980.
Список литературы
1. Levy S. B., Marshall B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses // Nature Medicine. 2004. V.10. P. 122 -129.
2. Sommer M. O.A., Dantas G., Church G. M. Functional characterization of the antibiotic resistance reservoir in the human microflora // Science. 2009. V. 325. № 000. P. 1128-1131.
3. Pepoyan A., Mirzabekyan S., Aminov R. Antibiotic resistance in commensal Escherichia coli in Armenia // Electronic Journal of Natural Sciences. 2005. P. 28-31.
4. Papadopoulos V. P., Giaglis S., Mitroulis I., Ritis K. The population genetics of familial Mediterranean fever: A Meta‐analysis study // Annals of human genetics. 2008. V. 72. № 6. P. 752-761.
5. Touitou I., Sarkisian T., Medlej-Hashim M., Tunca M., Livneh A., Cattan D., Yalçinkaya F., Ozen S., Majeed H., Ozdogan H., Kastner D., Booth D., Ben-Chetrit E., Pugnère D., Michelon C., Séguret F., Gershoni-Baruch R. Country as the primary risk factor for renal amyloidosis in familial Mediterranean fever // Arthritis Rheum. 2007. V. 56. № 5. P. 1706-1712.
6. Harutyunyan N. A., Pepoyan E. S., Manvelyan A. M., Balayan M., Pepoyan A., Horie H. Gionchetti P. Quantitative and qualitative changes of commensal Enterobacteriaceae in gut microflora of patients with familiar Mediterranean fever disease // Electronic Journal of Natural Sciences. 2007. V. 1. P. 41-44.
7. Johnson J. R., Sannes M. R., Croy C., Johnston B., Clabots C., Kuskowski M. A. Antimicrobial drug resistant Escherichia coli from humans and poultry products, Minnesota and Wisconsin, 2002–2004 // Emerg Infect Dis. 2007. V. 13. P. 838-846.
8. Tadesse D. A., Zhao S., Tong E., Ayers S., Singh A., Bartholomew M. J., McDermott P. F. Antimicrobial drug resistance in Escherichia coli from humans and food animals, United States, 1950–2002 // Emerg Infect Dis. 2012. V. 18. № 5. P. 741-749.
9. Murray P. R., Baron E. J., Pfaller M. A., Tenover P. C., Yolken R. H. Manual of clinical microbiology. 6th ed. Washington, DC: ASM Press. 1995.
10. Hofle M. G., Kirchman D. L., Christen R., Brettar I. Molecular diversity of bacterioplankton: link to a predictive biogeochemistry of pelagic ecosystems // Aquat. Microb. Ecol. 2008. V. 53. P. 39-58.
11. , Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиол. 2004. Т. 1. С. 84-92.
Подписи к рисункам.
Рисунок 1. Сравнительный анализ операционных таксономических единиц кишечных бактерий рода Escherichia больных Периодической болезнью и здоровых добровольцев.
Контролем являлись здоровые добровольцы, тестируемой группой – больные Периодической болезнью.
P < 0.05 – считается статистически достоверным.
Рисунок 2. Сравнительный анализ операционных таксономических единиц кишечных бактерий рода Escherichia больных Периодической болезью до приема "Наринэ" (а), через месяц после прекращения приема "Наринэ" (б) и через 1.5 месяца после прекращения приема "Наринэ" (г).
P < 0.05 – считается статистически достоверным.
Рисунок 3. Сравнительный анализ операционных таксономических единиц кишечных бактерий рода Escherichia здоровых добровольцев до приема Плацебо (а), через месяц после прекращения приема Плацебо (б), до приема "Наринэ" (а') и через 1.5 месяца после прекращения приема "Наринэ" (б').
P < 0.05 – считается статистически достоверным.
Таблица 1. Сравнительный анализ количества комменсальных E. coli в кишечной микробиоте больных семейной средиземноморской лихорадкой.
Log КОЕ/г (Average ± STDEV) | Группа больных, принимающих пробиотик "Наринэ" | Группа больных, принимающих Плацебо | ||||
До применения | После пробиотикотерапии* | Через 1.5 месяца после пробиотикотерапии* | До применения | После применения Плацебо* | Через 1.5 месяца после применения Плацебо* | |
E. coli | 7.54 ± 0.69 | 6.54 ± 0.83 (P < 0.05) | 7.05 ± 0.75 (P < 0.05) | 7 ± 0.67 | 7.09 ± 0.5 (P < 0.5) | 7.12 ± 0.97 (P = 1.27) |
P < 0.05 – считается статистически достоверным *- Результаты сравнивались с результатами до терапии. |
Таблица 2. Профили антибиотикорезистентности комменсальных E. coli больных семейной средиземноморской лихорадкой.
Изоляты, % | группа Плацебо | группа "Наринэ" | ||
до N1=15 n2=99 | После** N=13 n=78 | до N=15 n=87 | После** N=10 n=53 | |
Тетрациклины Tc, Dc | 88 | 55 | 87 | 64 |
β-лактамы Ac Cp, Cf | 54 | 27 | 38 | 25 |
Левомицетин | 12 | 12 | 0 | 13 |
Чувствительные | 11 | 40 | 13 | 34 |
Мультирезистентные* | 54 | 22 | 38 | 23 |
Резистентные | 35 | 38 | 56 | 42 |
* - резистентные по крайней мере к двум классам антибиотиков. 1- количество добровольцев, 2 – количество изолятов. Тетрациклин - Tc, доксициклин - Dc, амоксициллин - Ac, ципрофлоксатин - Cp и цефазолин - Cf **P < 0.05 – считается статистически достоверным. |
Antibiotic resistance of commensal Escherichia coli from the gut microbiota of familial Mediterranean fever disease patients
A. Z. Pepoyan*,1 , M. H. Balayan*, N. A. Harutyunyan*, A. Grigoryan*, V. V. Tsaturyan**, A. M. Manvelyan*, E. Dilanyan** Y. Piceno***, T. Torok***.
*Armenian National Agrarian University, Yerevan, Armenia
**International Association for Human and Animals Health Improvement, Yerevan, Armenia
** Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, USA
1Corresponding author (e-mail: *****@***ru)
In the presented study the qualitative and quantitative composition of gut Escherichia from the familial Mediterranean fever (FMF) disease patients have been investigated by the high-density DNA microarray analysis (PhyloChipTM) and by the use of clinical culture analyses. The increase of OTU numbers of genus Escherichia for these patients was revealed.
The high proportion of resistant and multiresistant isolates in gut microbiota of FMF patients has been revealed during the investigations on antibiotic resistance of commensal E. coli.
The studying of the influence of commercial probiotic "Narine" (Vitamaks-E, Armenia) on gut microbiota composition of FMF patients showed that the probiotic therapy leads to the reduction of OTU numbers of genus Escherichia. It is also revealed that after probiotic reception the amount of multiresistant E. coli isolates decreases in Placebo and "Narine" groups of FMF patients. The mechanism of action of probiotic formulation "Narine" on an exchange of gut bacteria and on an gut bacterial antibiotic resistance is being actively discussed by us.
Keywords: familial Mediterranean fever, clinical culture analyse, PhyloChipTM, Escherichia, antibiotic resistance, probiotic.
