Состояние митохондрий клеток карциномы легких Льюис при воздействии магниточувствительного нанокомплекса и радиочастотной гипертермии
, ,
Национальный институт рака, Киев
Электронно-микроскопическое исследование митохондрий клеток карциномы легких Льюис после внутривенного введения магниточувствительного нанокомплекса на основе наночастиц оксида железа (Fe3O4) и доксорубицина с последующей радиочастотной гипертермией показало, что на фоне общего увеличения электронной плотности цитоплазмы наблюдались отеки митохондрий по сравнению с органеллами животных, получавших только доксорубицин. При этом происходил практически тотальный лизис крист и резкое просветление матрикса, что регистрировалось существенным увеличением средней яркости изображений митохондрий. Результаты морфометрического анализа свидетельствуют об уменьшении периметра, площади и среднего радиуса митохондрий опухолевых клеток у животных под влиянием магниточувствительного нанокомплекса с последующей радиочувствительной гипертермией по сравнению с действием только доксорубицина. Гистограммы распределения периметра, площади и среднего радиуса митохондрий после комбинированного действия нанокомплекса и гипертермии приобретали форму бимодального асимметричного распределения. Введение магниточувствительного нанокомплекса с последующей радиочувствительной гипертермией приводило к более существенному повреждению ультраструктуры митохондрий опухолевых клеток по сравнению с действием только доксорубицина.
Ключевые слова: карцинома легких Льюис, митохондрии, магниточувствительный нанокомплекс, радиочастотная гипертермия
Адрес для корреспонденции: *****@***; *****@***com.
Экспериментальные исследования свидетельствуют о перспективе использования наночастиц оксида железа (Fe3O4) с противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда доксорубицином в качестве магниточувствительного нанокомплекса (МНК) при последующей радиочастотной гипертермии (РГТ) опухоли [10]. Противоопухолевое действие МНК под влияние РГТ связывают с повышением способности антрациклинов в присутствии Fe3O4 метаболизироваться клетками с образованием свободных радикалов. Хиноновая часть тетрациклинового кольца доксорубицина превращается в семихиноновый свободный радикал при участии митохондриальных, ядерных и микросомальных NADP-оксидоредуктаз клетки [6].
Окислительное повреждение ультраструктуры митохондрий может быть важным фактором в потере физиологических функций и последующей гибели клеток [5]. Известны публикации, в которых отмечены факты ингибирования опухолевого роста при наличии повреждения митохондрий, вызванного окислительным стрессом [11].
Цель данной работы -- исследование влияния МНК и РГТ на ультраструктуру митохондрий клеток карциномы легких Льюис (ККЛЛ).
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на мышах-самцах линии C57BL/6 (Авт! Так?Исправлено) (n=30) массой 18-20 г (виварий Национального института рака). Трансплантацию ККЛЛ осуществляли введением животным в правое бедро 30% суспензии клеток в объеме 0.4 мл в среде 199 согласно методике [8]. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой: 1-я -- контроль (интактные мыши), 2-я -- введение доксорубицина; 3-я -- введение МНК и РГТ. (Авт! так?ДА) В работе использовали МНК на основе наночастиц Fe3O4 со средним диаметром 20-40 нм, полученные на основе электронно-лучевой нанотехнологии [1] и доксорубицин ("Pfizer"). Синтез МНК проводили механомагнетохимическим методом, инициировавшим существенное увеличение парамагнитных центров в МНК по сравнению с их концентрацией в официнальном доксорубицине [3].
На 3-и сутки после перевивки опухоли животным в хвостовую вену вводили доксорубицин в массовой концентрации 1.5 мг/кг или МНК (1.5 мг/кг доксорубицина и 3 мг/кг Fe3O4 в объеме 0.3 мл в растворе NaCl). (Авт! так?ДА) В зоне опухоли располагали постоянный магнит с магнитной напряженностью 1990 А/м для локализации МНК в области развития опухоли. Последующую локальную РГТ опухолей проводили в течение 15 мин с помощью аппарата "Магнитерм" ("Радмир") при выходной мощности 100 Вт. При этом внутриопухолевая температура не превышала 39оС. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных.
Материал для исследования, полученный после выведения мышей из эксперимента с помощью 200 мг/кг тиопентала натрия, брали через 5 сут после перевивки опухоли, фиксировали в 2.5% растворе глутаральдегида и дофиксировали в 1% растворе OsO4, обезвоживали и уплотняли в смеси эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в микроскопе JEOL-100B ("Jeol").
Сегментацию и морфометрию цифровых электронных микрофотографий осуществляли с помощью оригинальной компьютерной программы [4]. Для проверки статистической значимости морфометрических параметров 1338 цифровых изображений митохондрий использовали параметрические и непараметрические критерии программного пакета "IBM SPSS Statistics 20".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Визуальный анализ микрофотографий свидетельствует о том, что в контрольной группе животных опухоль состояла из сравнительно крупных клеток, которые имели округлые ядра с умеренным количеством гетерохроматина (рис. 1, а). Цитоплазма имела достаточно равномерную электронную плотность; в ней хорошо визуализировались основные органеллы, в том числе мелкие митохондрии. В большинстве митохондрий наблюдалась гомогенизация крист, межмембранное пространство визуально определялось редко. Плазмалемма формировала множественные мелкие выросты. У мышей, получавших доксорубицин, размеры опухолей были меньше, чем в контроле. Ядра опухолевых клеток в большинстве случаев были меньшего размера, деформированные, с гиперконденсированным хроматином. Цитоплазма выглядела пенистой; наблюдалась незначительная гиперхромия ее ультраструктурных компонентов. Митохондрии были несколько набухшими и просветленными (рис. 1, б). Кристы были подвергнуты деструкции, фрагментации и лизису, а матрикс был просветленным. Плазмалемма опухолевых клеток формировала выросты, достигающие значительной длины. Опухоли у животных, получавших МНК и подвергшихся РГТ, характеризовались более отчетливыми изменениями: наблюдали резкое уменьшение размеров клеток и отек (рис. 1, в). Ядра опухолевых клеток были пикнозированы преимущественно гиперконденсированным хроматином (Авт! Так?), но среди грудок (Авт! скоплений?) последнего встречались электронно-просветленные участки. Ядра опухолевых клеток были пикнозированы с преимущественно гиперконденсированным хроматином, но среди глыбок последнего встречались электронно-просветленные участки. На фоне общего увеличения электронной плотности цитоплазмы наблюдались отеки митохондрий по сравнению с органеллами животных, получавших только доксорубицин. При этом происходил практически тотальный лизис крист и резкое просветление матрикса. От поверхности клеток отходили многочисленные тонкие выросты, а местами наблюдалась отшнуровка более массивных фрагментов цитоплазмы.
Компьютерный анализ цифровых изображений свидетельствует об уменьшении периметра, площади и среднего радиуса митохондрии ККЛЛ в исследуемых группах в следующей последовательности: контроль→доксорубицин→МНК+РГТ (таблица). Средняя яркость митохондрий была наибольшей в 3-й группе, что было обусловлено лизисом крист. Параметр энтропии для митохондрий под влиянием комбинированного действия МНК и РГТ был минимален. Гистограммы распределения периметра (рис. 2), площади и среднего радиуса митохондрий, имеющие унимодальную форму в контроле и после введения доксорубицина, в результате комбинированного действия МНК и РГТ приобретали форму бимодального асимметричного распределения, что демонстрирует характерные особенности влияния МНК и РГТ на более существенное снижение размеров и увеличение гетерогенности исследуемой популяции митохондрий по сравнению с действием доксорубицина.
Проведенные нами ранее исследования [2] свидетельствуют о том, что комбинированное действие РГТ и МНК на животных с карциномой легких Льюис инициирует больший противоопухолевый и антиметастатический эффекты, чем доксорубицин. При этом активность FeS-белков N1а и N1b электрон-транспортной цепи митохондрий была минимальна, а изменения содержания комплексов негемового железа с NO максимальны в карциноме легких Льюис (Авт! в клетках опухоли или в опухоли вообще? В опухоли вообще. Исправлено.) под влиянием МНК и РГТ.
По-видимому, механизм наблюдаемого эффекта заключается в более интенсивном локальном инициировании МНК и РГТ окислительно-восстановительных реакций свободных радикалов [9] и процессов нарушения переноса электронов в электрон-транспортных цепях митохондрий, что инициирует процессы апоптоза и некроза опухолевых клеток, замедляя скорость роста опухоли [7].
Полученные данные показали, что под действием МНК и РГТ наблюдаются более выраженные морфологические изменения митохондрий ККЛЛ, чем под действием доксорубицина. Это увеличивает вероятность нарушения функций митохондрий как структуры, отвечающей за энергетические процессы в опухолевых клетках (Авт! Так? ДА).
ЛИТЕРАТУРА
1. // Вестник фармакологии и фармации. 2007. № 12. C. 5-13. Уточнить выходные данные. Уточнено.
2. , , и др. // Променева діагностика, променева терапія. 2011. № 3-4. С. 20-28. Уточнить выходные данные. Уточнено.
3. , Шевченко Ю. Г. и др. // Металлофизика и новейшие технологии. 2010. Т. 32, № 9. С. 1157-1167. Уточнить автора. Уточнено.
4. , , и др. Радиочастотная гипертермия злокачественных новообразований, нанотехнологии и динамический хаос. Тернополь, 2012.
5. , , и др. // Биохимия. 2005. Т. 70, № 2. С. 294-301.
6. , // Вопр. онкол. 2010. Т. 56, № 3. С. 251-261.
7. Kotamraju S., Chitambar C. R., Kaliverdi S. V. et al. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, N 19. P. 17 179-17 187.
8. Matsuzaki T., Yokokura T. // Cancer Immunol. Immunother. 1987. Vol. 25, N 2. P. 100-104. Дать ссылку на этот источник в тексте. Сделано
9. Symons M., Gutteridge J. Free Radicals and Iron: Chemistry, Biology, and Medicine. Oxford, 1998.
10. Thiesen B., Jordan A. // Int. J. Hyperthermia. 2008. Vol. 24, N 6. P. 467-474.
11. Yu M. X., Chen W. L., Zhou Q., Gao P. // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2010. Vol. 235, N 9. P. 1053-1061.
Получено 13.08.12
Компьютерный анализ цифровых изображений митохондрий (M±m)
Параметр
Группа
контроль
доксорубицин
МНК+РГТ
Периметр, мкм 1.27±0.02 1.10±0.02* (86) 0.96±0.02*+ (75)
Площадь, мкм2 0.085±0.002 0.072±0.003* (86) 0.064±0.002*+ (75)
Средний радиус, мкм 0.163±0.002 0.147±0.003* (90) 0.123±0.003*+ (76)
Средняя яркость, отн. ед. 185±1 181±1 (98) 205±1*+ (111)
Энтропия 4.69±0.02 4.81±0.02* (103) 4.47±0.02*+ (95)
Примечание. В скобках -- % относительно контроля. р<0.05 по сравнению *с контролем, +с доксорубицином.
Рис. 1. Митохондрии в ККЛЛ через 5 сут после перевивки, *10 000.
Здесь и на рис. 2: а -- контроль; б -- доксорубицин; в -- МНК+РГТ. (Авт! стрелки на фрагментах указывают на митохондрии? ДА)
Рис. 2. Гистограммы распределения периметра митохондрий ККЛЛ.
