УДК: 575.167
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ИЗУЧЕНИЮ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА
Кафедра генетики КемГУ
*****@***ru
Микроядра (МЯ) — это небольшие ДНК-содержащие тельца, существующие в клетке отдельно от основного ядра (ядер) или связанные с ними хроматиновым мостом. Их возникновение связывают, как правило, с такими типами повреждения генома как ацентрические фрагменты хромосом или целые хромосомы, отставшие в ана-телофазе митоза от веретена деления и не вошедшие в дочерние ядра. Строго такой механизм образования МЯ был доказан in vivo для проэритробластов мыши и in vitro для лимфоцитов человека. В то же время в исследованиях было показано, что образование микроядра — это не всегда только постмитотическое событие. Например, МЯ могут образовываться в фазе синтеза ДНК из ядерных почек, а также, видимо, во всех тех случаях, когда клетка избавляется от избытка ДНК (избыточная амплификация, реверсия культур клеток опухоли путем экскреции онкогенов). Таким образом, микроядро — это свидетельство количественных изменений ДНК в живой клетке, свидетельство наличия нарушений в процессах репарации ДНК и других нарушений нормально функционирования организма на клеточном уровне [1].
Цель исследований – изучить перспективы использования микроядерного теста в оценке воздействия на организм человека различных генотоксических агентов.
Использование микроядр в качестве меры хромосомных повреждений в лимфоцитах периферической крови было впервые предложено Countryman, Heddle (1976), а затем улучшено с развитием метода МЯ-теста в условиях цитокинетического блока (CBMN) (Fenech, Morley, 1985), что позволило подсчитывать МЯ в клетках, в которых принудительно было остановлено деление. Как следствие, анализ стал широко применяется для оценки наличия и степени повреждения хромосом у людей, подвергающихся воздействию генотоксических агентов в связи со своей профессиональной деятельностью, фоновым загрязнением окружающей среды и образом жизни [2].
Кроме этого, анализ можно проводить для оценки риска генетических нарушений и возникновения некоторых заболеваний. По сути, микроядра – это биомаркеры неблагоприятного воздействия на здоровье [2].
Для того, чтобы стало возможно проведение анализа, кровь обследуемого следует культивировать 44 часа при температуре 37˚С в присутствии ФГА. По истечении времени в каждую культуру добавляют цитохалазин Б и культивируют еще 24 часа при той же температуре. Затем клетки суспендируют во флаконе, переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут на скорости 1000 об/мин. Затем пробы проходят несколько этапов фиксации, после чего их раскапывают на сухие холодные стекла и высушивают на воздухе. Далее препараты окрашивают азур-эозином. При этом цитоплазма клеток приобретает голубой цвет, а ядра и микроядра – интенсивный сине-фиолетовый.
Препараты анализируют под микроскопом в проходящем свете с использованием матового фильтра при увеличении 800-1000 раз (масляная иммерсия). Далее производится подсчет одно-, двух-, трех-, четырех - и полиядерных лимфоцитов, митотических клеток, клеток, находящихся в состоянии апоптоза.
Микроядра идентифицируют как лежащие в цитоплазме четко отделенные от ядер округлые хроматиновые тела с непрерывным гладким краем, имеющие тот же рисунок хроматина, что и основное ядро. Диаметр микроядр не превышает 1/4 диаметра ядра. Помимо этого отмечаются клетки с различными нарушениями структуры, например, хроматиновые мосты, перетяжки и т. д. Подсчет ведется на 1000 клеток [3].
МЯ-тест привлекает повышенное внимание лабораторий, действующих в области охраны окружающей среды и мутагенеза, и количество опубликованных исследований по этой методике быстро растет. Распространение анализа МЯ в основном объясняется двумя причинами: 1) тест является надежной оценкой хромосомных повреждений, более низкой по стоимости и менее трудоемкой, чем метод хромосомных аберраций, а также 2) появление методики цитокинетического блокирования позволяет устранить воздействие различных факторов на клеточное деление. Как и в других цитогенетических анализах, существует вариабельность и ограниченность лабораторного метода с учетом образа жизни и роли индивидуальной восприимчивости в изменчивости [2].
Одним из главных вопросов, обсуждаемых в литературе, является влияние различных разновидностей методик на частоты МЯ. Было установлено, что при использовании различных вариаций результаты опыта могут быть одинаковыми, а иногда и различными. Исследования, предназначенные для сравнения различных концентраций цитохалазина Б показали, что концентрация 6 мг/мл хотя и более эффективна, чем стандартная концентрация 3 мг/мл, но вызывает понижение частоты МЯ. В тоже время, Prosser и др.(1988) не нашли различий в эффектах двух концентраций на частоты МЯ. Fenech (1998) сообщил, что сравнительное исследование двух различных культур – RPMI 1640 и McCoy, не выявило различий в частоте МЯ [4].
Несмотря на явные преимущества МЯ-теста он имеет и некоторые недостатки, как, например, невозможность определения состава микроядра и его происхождения, и, следовательно, существование вероятности ошибочной интерпретации результатов. Yoon Hee Cho и др. в своих исследованиях влияния ионизирующего излучения на частоту микроядр в лимфоцитах у рентгенологов пользовались FISH-методом (fluorescence in situ hybridization). В этом методе для обнаружения МЯ, полученных из ацентрических хромосом, фрагментов или целых хромосом, используется пан-центромерный зонд. Ими было обследовано 47 рентгенологов, подвергающихся воздействию низких доз ионизирующего излучения и 47 людей из контрольной группы. МЯ без центромер (MNC-) значительно чаще встречались у рентгенологов, чем в контроле, в то время как аналогичные микроядра с центромерами (MNC+) наблюдались и в той, и в другой группе. С помощью регрессионного анализа Пуассона было выявлено, что частота МЯ без центромер в значительной степени связана с радиационным воздействием и с накоплением дозы облучения. Также большую роль играют такие факторы, как возраст, курение, употребление алкоголя и генотип. Таким образом, данный комбинированный метод позволил выявить, что наиболее объективным показателем повреждающего воздействия генотоксического агента является наличие в пробе микроядр без центромер [5].
На основе проанализированной литературы мы сделали вывод, что оценка уровня микроядр в лимфоцитах периферической крови, культивируемых в условиях цитокинетического блока, является перспективным, доступным и информативным методом оценки повреждающего воздействия генотоксических агентов на хромосомы человека.
Литература:
1. Ингель использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока //Экологическая генетика. – том IV, №3, 2003. – С.7 – 9;
2. Bonassi S., Fenech M. et al. HUman MicroNucleus Project: International Database
Comparison for Results With the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay in Human Lymphocytes // Environmental and Molecular Mutagenesis, 45. – Wiley-Liss, Inc., 2001. – P.32 – 43;
3. , Сычева микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях. - М.: Гениус, 2007. – 312с;
4. Fenech M., Holland N. et al. The HUman MicroNucleus Project—An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans // Mutation Research, 428. – 1999. – Р.271 – 283;
5. Yoon Hee Choa, Yang Jee Kima et al. Micronucleus-centromere assay and DNA repair gene polymorphism in lymphocytes of industrial radiographers //Mutation Research, 680. – 2009/ - P.17–24
Научный руководитель – д. б.н., проф.,
