Термоадсорбционное разделение ДНК по размерам с помощью полимерного сорбента

УДК 541.64.53; 577

ТЕРМОАДСОРБЦИОННОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ДНК

ПО РАЗМЕРАМ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРНОГО СОРБЕНТА

1, 2, 3, 2,

2

1Институт гематологии АН РУз, 100059 Ташкент, а, Узбекистан

2Институт химии и физики полимеров АН РУз, 100128 Ташкент, Б, Узбекистан

3Biological department, Webster University, 470 E. Lockwood ave., Webster Groves, MO 63119, USA

Поступила в редакцию

Аннотация

В статье рассмотрены важные теоретические аспекты проблемы выделения и разделения ДНК по размерам с помощью полимерного сорбента и разработка на этой основе теоретической модели процесса термодесорбции фрагментов ДНК различной длины. Предполагая, что при определенных значениях рН взаимодействие ДНК с полимерным сорбентом имеет ион-дипольный характер и подвижные диполи сорбента взаимодействуют согласно распределению Больцмана с суммарным зарядом фрагмента ДНК, находящегося в его поре, получено выражение для энергии взаимодействия в зависимости от температуры. Приравнивая тепловую энергию к энергии взаимодействия ион-дипольного характера, находится критическая температура разделения ДНК от сорбента. Учет конформации одноцепочечной ДНК в виде клубка приводит к зависимости температуры разделения ДНК, т. е. десорбции, от длины цепи ДНК. Причем температура для десорбции увеличивается симбатно длине контура ДНК.

Ключевые слова: ДНК, полимерный сорбент, ион-дипольное взаимодействие, термодесорбция

Введение. Для быстрого и эффективного выделения фрагментов ДНК в процессах адсорбции и десорбции в качестве сорбента широко используются известные силикагелевые частицы [1-3]. Влияние геометрических характеристик и характера физического взаимодействия этих частиц с фрагментами ДНК на процессы адсорбции и десорбции ДНК при различных рН изучено достаточно глубоко [1-3]. В этих работах выявлена движущая сила адсорбции ДНК на силикагелевые частицы, которая обусловлена в основном с энтропийным выигрышем при адсорбции по сравнению с отталкивательными силами между отрицательными группами ДНК и силикагеля. Установлено, что внешними факторами, влияющими на адсорбцию ДНК на поверхность силикалевых частиц, являются рН, лиганды, ионная сила раствора. Наиболее оптимальными условиями адсорбции ДНК на поверхность силикагеля являются рН около или ниже рК поверхности силикагеля, высокая ионная сила раствора, а также определенные виды лигандов, создающих новые адсорбционные центры на силикагеле. Зависимость от рН авторы объясняют тем, что при низких рН уменьшается количество отрицательных заряженных групп адсорбента, тем самым улучшается адсорбция отрицательно заряженной ДНК на положительно заряженные группы силикагеля. При аминировании поверхности силикагелевых частиц резко улучшается адсорбция ДНК за счет электростатического взаимодействия между ДНКи аминными группами силикагеля. В последнее время в литературе появилась эмпирическая работа [4], в которой было показано эффективная адсорбция ДНК на пористый биополимер хитозан, обладающими уникальными сорбирующими свойствами [5]. Но в ней не исследованы движущие силы адсорбции макромолекулы ДНК на поры хитозана с полярными аминными группами в зависимости от геометрических характеристик ДНК, адсорбента, а также внешних факторов типа рН или температура.

С этой точки зрения представляет большой научный интерес теоретический анализ процессов адсорбции и десорбции фрагментов ДНК различных длин на полимерный сорбент с полярными группами типа хитозана в зависимости от внешних факторов, влияющих на эти процессы.

Модель. Рассмотрим взаимодействие заряженного адсорбата (ДНК) с дипольными моментами полярных групп пористого сорбента. Согласно теореме Гаусса-Остроградского [6], поле зарядов, расположенных на адсорбате и попавших в пору адсорбента, можно рассматривать как поле от суммарного заряда, расположенного в центре замкнутой поры. При этом ион-дипольное взаимодействие является причиной удерживания заряженных молекул на полярных фазах сорбента (рис. 1, а, б).

Потенциальная энергия притяжения между заряженным адсорбатом и диполем полярной группы описывается следующим выражением [7]:

, (1)

где p – дипольный момент диполя, q – заряд иона, - угол между вектором напряженности поля и дипольным моментом, - диэлектрическая проницаемость среды, - диэлектрическая проницаемость вакуума, r – расстояние между ионом и диполем. Полная энергия взаимодействия иона со всеми диполями полярных групп адсорбента является суммой энергий взаимодействия с каждым диполем. Тогда выражение для полной энергии имеет вид:

, (2)

где N – количество полярных групп в поре, - среднее значение косинуса угла , взятое по пространственному распределению дипольных моментов в состоянии теплового равновесия, равно

, (3)

где - функция распределения дипольных моментов полярных групп. Распределение можно выбрать в нескольких различных вариантах, характерных для конкретных систем. С большой степенью общности все рассматриваемые системы можно разделить на три типа: 1) неподвижные диполи на молекулах сорбента имеют постоянное направление относительно оси полимера (), 2) неподвижные диполи распределены случайно относительно оси макромолекулы и 3) подвижные диполи распределены в соответствии с законом Больцмана . В первом случае, когда , имеем

. (4)

В этом случае потенциальная энергия взаимодействия будет

. (5)

Во втором случае в силу случайного характера распределения диполей относительно оси цепи, что приводит к нулевой полной энергии взаимодействия. В состоянии теплового равновесия, т. е. в третьем случае, имеет место закон распределения Больцмана, и распределение для него будет . Для этого случая [7], где L(x) – функция Ланжевена. В случае pE<<kT получаем

. (6)

Количество полярных групп на поверхности поры радиуса Ro можно записать в виде:

, где no – число диполей в единице объема хитозана, - поперечный размер макромолекулы сорбента. Отметим, r= Ro.

Рассмотрим две различные ситуации: 1) размер пор соизмерим с персистентной величиной сорбата () и 2) размер пор намного больше персистентной длины, .

1-случай (). Учтем, что заряд на ДНК равен , где d0 – расстояние между зарядами на ДНК. Тогда энергия взаимодействия ДНК с диполями полимера в поре будет иметь вид:

. (7)

Как видно из этого выражения, величина энергии взаимодействия ДНК с диполями не зависит от радиуса поры. Этот нетривиальный результат годится для случая, когда диаметр пор меньше или порядка персистентной длины ДНК [8,9].

2-случай. Размер пор намного больше персистентной длины, . Конформация куска ДНК, вошедшего в пору полимера, имеет вид клубка. В этом случае размер клубка определяется выражением [9]. Отсюда заряд этого отрезка ДНК равен:.Тогда энергия взаимодействия ДНК с диполями полимера имеет вид

. (8)

Таким образом, во втором случае энергия взаимодействия ДНК с диполями полимера больше по сравнению с первым случаем и, кроме этого, зависит от размера клубка, который заполняет всю пору.

Оценка критической температуры удержания ДНК порой полимера. Условие того, что кусок ДНК, адсорбированный порой, будет удерживаться этой порой до достижения температуры Т*, будет выглядеть следующим образом (коэффициент оценивается с помощью специальной манипуляции – см. Приложение 1). Из этого выражения получаем условие на Т* с учетом формулы (8) для общего выражения энергии взаимодействия заряда и диполями: . Для рассматриваемых двух случаев это дает соответственно

(К). (9)

(К). (10)

Как видно из последних выражений, критическая температура удержания фрагмента ДНК в полимере зависит от свойств адсорбента (p, no, d, Ro), адсорбата (do, l) и среды заполняющей пору (e). Причем для первого случая, когда размер пор порядка персистентной длины, зависимость от размера пор пропадает, тогда как во втором случае, когда размеры пор намного больше персистентной длины, критическая температура зависит от размера пор, т. е. для десорбции более длинных фрагментов ДНК из пор полимера требуются более высокие температуры. Отметим, то зависимость энергии адсорбции от ионной силы раствора можно анализировать через эффективную диэлектрическую константу на основе теории Дебая-Хюккеля. При увеличении ионной силы эффективная диэлектрическая константа увеличивается, что в свою очередь уменьшает энергию взаимодействия между ионом ДНК и диполями поверхности поры.

Таким образом, на основании приведенного выше теоретического анализа можно предложить метод термоадсорбционной спектроскопии фрагментов ДНК различных длин.

Алгоритм метода заключается в следующем:

1-этап. Адсорбция молекул ДНК на поры полимера с определенным распределением размера при низких температурах (меньше ).

2-этап. С повышением температуры до происходит десорбция кусков ДНК с длиной порядка или меньше длины сегмента ДНК.

3-этап. При дальнейшем повышении температуры до десорбируются фрагменты ДНК с длиной , т. е. постепенно выделяются сначала маленькие фрагменты ДНК, затем и большие фрагменты ДНК, согласно следующему выражению:

. (11)

Выражая длину контура L через количество пар азотистых оснований b и расстояние между азотистыми основаниями, т. е. , получим следующую зависимость температуры десорбции от количества пар азотистых оснований . Подставляя в это выражение значения , [9] (для одноцепочечной ДНК) получим (рис. 2). Здесь мы не учли полиэлектролитный эффект, который приводит к увеличению значения персистентной длины, что уменьшает коэффициент пропорциональности между температурами Т2 и Т1.

Оценим значения параметров задачи, входящие в выражение (11) для такого биосорбента как хитозан [5,10]. Пусть средний размер пор в хитозане будет около 4 нм, а поперечный размер молекулы хитозана . Число диполей в единице объема хитозана можно определить по формуле , где Nаt – число атомов хитозана в элементарной ячейке с объемом Vэ. я., а a - доля диполей в элементарной ячейке. Оценки показывают, что . Рассчитаем дипольный момент полярной группы - NH2. Дипольный момент равен

, (12)

где координаты двух атомов водорода и азота, qH и qN – их заряды, расстояние от азота до середины линии, соединяющей два атома водорода. Квантово-химические расчеты показывают, что атом азота полярной группы хитозана имеет до -0.9е заряда [11]. Тогда дипольный момент при R=0.4 нм равен . Расстояние между зарядами do в цепи ДНК равняется среднему размеру нуклеотидов ДНК (0.34 нм). Оценки на основе формулы (6) показывают, что энергия взаимодействия фрагмента ДНК в поре с хитозаном при комнатной температуре составляет около . Подставляя эти значения параметров хитозана в уравнение (9) приблизительно получаем . В диапазоне температур вплоть до температуры деструкции ДНК можно предположить, что обсуждаемым термоадсорбционным методом можно разделять фрагменты ДНК до 100 азотистых оснований. Для применения метода для более длинных фрагментов ДНК необходим выбор полимерного сорбента с меньшей величиной дипольного момента и меньшей плотности.

Хотелось бы отметить, что в наших расчетах мы пренебрегли энтропийными потерями при переходе макромолекулы из растворителя в пору адсорбента, предполагая, что эти потери намного меньше, чем энергетический выигрыш при взаимодействии сегментов макромолекулы с поверхностью адсорбента, что справедливо при размерах клубка не больше размера полости [9].

В связи с обсуждаемой методикой дифференциации фрагментов ДНК по размером, важной оказывается проблема точности метода. Этот вопрос мы вынесли в приложение к статье.

Таким образом, термоадсорбционное разделение фрагментов ДНК различных длин с помощью полимерных сорбентов может быть эффективным методом дифференцировки ДНК по размерам и, тем самым, является в определенной степени дополнением к методу электрофоретического разделения ДНК по размерам [9].

Приложение 1

При анализе температурно-активационных процессов всегда встает вопрос о температуре, при которой надо считать эффективным вылет частицы над потенциальным барьером.

Весьма хорошим приближением, зачастую использующимся в физике активационных процессов [12], является равенство

(П. 1)

где Q – энергия активации в Больцмановском множителе . Это приближение можно назвать локальным. Вместе с тем, можно предложить и более тонкое приближение, эффективно учитывая Больцмановскую вероятность в неком диапазоне температур (нелокальное приближении). Покажем, как это можно сделать простейшим путем, а именно заменить равенство (П.1) на другое

(П. 2)

( положена равной единице). Отметим, если исходить из Больцмановской вероятности , то производная по температуре имеет максимум при , где .

Заменим теперь колоколообразное выражение

другим ,

(как это стандартно делается в идеологии метода перевала - см. [13]) и потребуем интегрального равенства

(П. 3)

Решение (П. 3) относительно дает

Таким образом, эффективная величина энергии активации, понижаясь за счет, вероятности преодоления барьера при , равна , т. е. - универсальная величина

Приложение 2

Мы рассуждаем следующим образом. Вероятность десорбции описывается очень резкой экспоненциальной функцией, поэтому условие эффективной десорбции является очень хорошим приближением в среднем диапазоне температур. Откуда же может взяться разброс величины вокруг С нашей точки зрения, это, несомненно, флуктуации температуры, которые могут быть и значительными при относительно высокой температуре десорбции, причем в не очень большом объеме квазиизолированной поры полимера - хитозана. Действительно, согласно теории термодинамических флуктуаций [14], имеем: ,

где - температура термостата, - теплоемкость при постоянном объеме вещества, содержащегося в поре.

Таким образом, для того чтобы число десорбирующихся молекул оставалось тем же при увеличении температуры до , необходимо, чтобы в процессе десорбции участвовали и более длинные молекулы с . Это условие определяется как .

Это дает относительный разброс в длинах молекул, десорбированных при температуре :

Очевидно, что зависимость от и антибатна и, поскольку растет с увеличением , то относительная ошибка метода примерно одинакова во всем диапазоне измерений.

Естественно, что все приведенные соображения основаны на представлении, что аппаратура для изучения числа десорбируемых молекул измеряет с бесконечной точностью.

Литература

Tian H., Hühmer A., Landers J Analytical biochemistry 283, 2000. C. 175-191. Melzak K. A., Sherwood C. S., Turner R. F. B. et al. Journal of Colloid and Interface Science 181, 1996. P. 635–644. Balladur V., Theretz A., Mandrand B., Journal of Colloid and Interface Science 194, 1997, P. 408–418 Nucleic acid isolation methods and materials and devices thereof, Патент US2009/0215124 A1 Hyunmin Yi., Li-Qun Wu., Bentley W. et al. Biomacromolecules, 2005. V.6. No 6. P. 2881 Тамм И.Е. Основы теории электричества. М.: Наука, 1989. С. 504. Киттель Ч. Введение в физику твердого тела. М.:Наука, 1978. С. 791. Биофизика. М.: Наука, 1981. С. 571. , Статистическая физика полимеров. Москва: Наука, 1989. С.344. , Хитин и хитозан Bombyx mori. Ташкент: ФАН, 2009. С. 246. , , “Журн структураной химии”, Том 53. Вып. 5. С. 1-7. Статистическая физика. М. – Л., Издательство АН СССР, 1948. С. 760. Качественные методы в квантовой теории. М. “Наука”, 1975. С. 336. Статистическая механика. – М.: КомКнига, 2007, С. 448.

 

б

а

Рис. 1. Адсорбция ДНК с отрицательно заряженными группами в пору полимера, имеющего полярные группы а) размер пор намного меньше персистентной длины, . б) размер пор больше размера клубка ()

Рис. 2. Зависимость нормированной температуры десорбции ДНК из пор хитозана от длины фрагментов ДНК, в единицах пар нуклеотидов, ().

Аширметов Абдурашид Хамидович - 100121, Ташкент, , Узбекистан, Тел: [phone]. E-mail: *****@***ru.

Азимов Жуманазар Тургунович – 100128, Узбекистан, Ташкент. Шайхантохурский р-н, дом.7б, кв.423. Тел: [phone] E-mail: *****@***ru (вести переписку по этому адресу).

Тураева Нигора Назаровна – 473 Catalina Ave., St. Louis, MO 63119, E-mail: *****@***edu

– 100128, Узбекистан, Ташкент. Ц-13, . Тел: [phone]. E-mail: *****@***ru

Рашидова Сайёра Шарафовна – Институт химии и физики полимеров АН РУз, 100128 Ташкент, Б, Узбекистан, Тел: [phone]. E-mail: [email protected]