ME E-0900 Инсулин ИФА
Набор реагентов для ИФА для количественного определения Инсулина в сыворотке и плазме.
Только для in vitro диагностики.
Инсулин – это главный гормон, отвечающий за контроль метаболизма глюкозы. Он синтезируется в β-клетках островков Лангерганса в виде прекурсора, проинсулина, который затем преобразуется в С-пептид и Инсулин. С-пептид и Инсулин затем секретируются в эквимолярных количествах в систему циркуляции. Зрелая молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей, А цепь и В цепь (21 и 30 аминокислот соответственно). Цепи связаны между собой дисульфидными мостиками. Существуют также дисульфидные мостики внутри А цепи. Секреция инсулина зависит от концентрации глюкозы в крови, и этот гормон имеет ряд важных метаболических свойств. Основной функцией инсулина является контроль поглощения и утилизации глюкозы в периферических тканях с помощью транспортера глюкозы. Эта и другая гипогликемическая активность, такая как ингибирование печеночного глюконеогенеза и гликогенолиза, нейтрализуют действие гипергликемических гормонов, таких как глюкагон, адреналин, гормон роста и кортизол. Концентрация инсулина значительно снижается при инсулинозависимом сахарном диабете (ИЗСД) и некоторых других условиях, таких как гипофизарный нанизм.
Уровень инсулина повышается при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД), ожирении, инсулиномы и некоторые эндокринные дисфункции, такие как синдром Кушинга и акромегалия.
Принцип теста:
Набор Инсулин ИФА основан на методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на принципе сэндвича.
Образцы пациента, стандарты и контроли подкислены и нейтрализуются непосредственно перед анализом.
Лунки покрыты моноклональными антителами к антигенам, расположенным на молекуле Инсулина.
Аликвоты образцов пациента, содержащие эндогенный инсулин, инкубируются в лунках с ферментным конъюгатом (анти-Инсулин антитела – Биотин). После инкубации несвязавшийся конъюгат вымывается.
Во время второго этапа инкубации ферментный Стрептовидин-пероксидазный комплекс связывается в биотин-анти-Инсулин антителами. Лунки промываются и инкубируются с ферментным комплексом (Стрептавидин-HRP-комплекс). Количество связавшегося HRP комплекса пропорционально концентрации Инсулина в образце.
После добавления раствора субстрата интенсивность цвета раствора пропорциональна концентрации Инсулина в образце.
Состав набора:
96 | Микротитровальный планшет |
12х8 (96 лунок), разборный; лунки покрыты моноклональными анти-Инсулин антителами.
Нулевой стандарт, 1 флакон, 3 мл, готов к использованию
0 мкМЕ/мл
Стандарты (1-5):
пять флаконов, по 1 мл, готовы к использованию.
концентрации: 6.25 - 12.5 – 25 - 50 и 100 мкМЕ/мл
Стандарты откалиброваны согласно рекомендациям ВОЗ,
NIBSC: 66/304.
Enzyme Conjugate, | Ферментный конъюгат |
1 флакон, 5 мл, готов к использованию;
мышиные моноклональные антитела конъюгированные с биотином
Enzyme Complex Ферментный комплекс
1 флакон, 7 мл, готов к использованию.
стрептавидин-HRP комплекс
Substrate Solution | Раствор субстрата |
1 флакон, 14 мл, готов к использованию; тетраметилбензидин (ТМБ).
Stop Solution | Стоп-раствор |
1 флакон, 14 мл, готов к использованию, содержит 0,5 М серной кислоты
Избегайте контакта со Стоп-раствором. Это может вызвать раздражение кожи и ожоги.
Wash Solution | Промывочный раствор |
1 флакон, 30 мл (40X концентрированный), см. "Подготовка реагентов".
Оборудование и материалы необходимые, но не входящие в комплект
- Микропланшетный анализатор (450±10)
- Откалиброванные переменные прецизионные микропипетки
- Абсорбирующая бумага
- Дистиллированная вода
Хранение и стабильность набора:
При хранении при температуре 2-8 ° С закрытые реагенты сохраняют активность до истечения срока годности. Не используйте реагенты после этой даты.
Открытые реагенты должны храниться при температуре 2-8 ° С.
Микротитровальный планшет должен храниться при температуре 2-8 ° С в плотно закрытом фольгированном пакете.
Подготовка реагентов:
Перед использованием все реагенты и необходимое количество стрипов должны быть комнатной температуры.
Промывочный раствор:
Добавьте к 30 мл концентрата промывочного раствора 1170 мл деионизированной воды, до конечного объёма 1 200 мл.
Разведенный промывочный раствор стабилен 2 недели при комнатной температуре.
Образцы:
Используется сыворотка или плазма (только гепарин - или цитрат-плазма)
Не используйте гемолизированные, желтушные и липемические образцы.
Хранение:
Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8° С до 5 дней.
Возможно более длительное хранение однократно замороженных образцов при – 20 ° С. Размораживание должно проводиться непосредственно перед исследованием.
Разведение образцов:
Если при анализе установлено, что образец содержит более высокую концентрацию, чем стандарты, то образцы можно разбавить Стандарт 0 и провести повторное исследование, как описано в процедуре анализа.
При расчете результата должен учитываться фактор разведения
Пример:
a) разведение 1:10: 10 мкл Образца + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
b) разведение 1:100: 10 мкл разведения а) + 90 мкл Стандарт 0 (тщательно перемешать)
Процедура анализа:
Перед применением все реагенты должны быть комнатной температуры. Стандарты, контроли и образцы должны исследоваться в дублях. Как только процедура анализа была начата, она должна быть завершена без перерыва.
1. Закрепите необходимое количество стрипов на штативе. 2. Добавьте по 25 мкл стандартов, контролей и образцов в соответствующие лунки новыми одноразовыми наконечниками. 3. Добавьте по 25 мкл ферментного конъюгата в каждую лунку. Тщательно перемешайте в течение 10 секунд. Важно добиться полного смешивания на этом этапе. 4. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре в закрытом планшете. 5. Резко вытряхните содержимое лунок. Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей бумаге. Важно: чувствительность и точность данного анализа зависит от правильного выполнения процедуры промывки. 6. Добавьте по 50 мкл Ферментного комплекса в каждую лунку. 7. Инкубируйте 60 минут при комнатной температуре. 8. Резко вытряхните содержимое лунок. Промойте каждую лунку 3 раза разведенным промывочным раствором (по 400 мкл на лунку). Для удаления остатков жидкости резко переверните планшет и прижмите к абсорбирующей бумаге. 9. Добавьте по 50 мкл Субстрата в каждую лунку 10. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре. 11. Для остановки ферментной реакции добавьте по 50 мкл Стоп-раствора в каждую лунку. 12. Измерьте ОП на микропланшетном анализаторе при 450±10 нм в течение 10 минут после добавления стоп-раствора. |
Расчет результатов:
1. рассчитайте среднюю оптическую плотность каждого стандарта, контроля и неизвестного
2. Нарисуйте калибровочную кривою на логарифмической бумаге со средней оптической плотности на Y-оси и концентрацией калибратора на X-оси. Если для анализа используется программное обеспечение, то рекомендуется кривая на 4-параметра.
3. Рассчитайте значение неизвестных при помощи калибровочной кривой.
4. Если концентрация образца выше стандартов, то образец должен быть разведен. При расчете результата необходимо учитывать фактор разведения.
Пример типичной стандартной кривой:
(не используйте для расчета)
Стандарт | ОП (450 нм) |
Стандарт 0 (0 мкМЕ/мл) | 0.03 |
Стандарт 1 (6,25 мкМЕ/мл) | 0.07 |
Стандарт 2 (12,5 мкМЕ/мл) | 0.14 |
Стандарт 3 (25 мкМЕ/мл) | 0.35 |
Стандарт 4 (50 мкМЕ/мл) | 0.88 |
Стандарт 5 (100 мкМЕ/мл) | 2.05 |
Ожидаемые нормальные значения:
Настоятельно рекомендуется, чтобы каждая лаборатория определяла свои границы нормальных и аномальных значений.
2 – 25 мкМЕ/мл
Диапазон:
0 – 100 мкМЕ/мл
Чувствительность:
1,76 мкМЕ/мл
