Соискатель стипендии:
Аспирант 3 года лаборатория сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН
Тема работы: Создание и тестирование технологии HLA типирования высокого разрешения, основанной на секвенировании нового поколения
Краткое представление:
C 2014 года являюсь аспирантом лаборатории сравнительной и функциональной геномики. Основные направления работы связаны с изучением генетической вариабельности соматических клеток организма с применением методов высокопроизводительного секвенирования. Результаты проектов, в которых я принимала непосредственное участие были представлены на российских и международных конференциях, а также опубликованы в журналах, включая публикацию первом автором. Имею опыт как лабораторной работы, так и в обработке результатов секвенирования. Список публикаций:
1. Kurnosov AA, Ustyugova SV, Nazarov VI, Minervina AA, Komkov AY, Shugay M, Pogorelyy MV, Khodosevich KV, Mamedov IZ, Lebedev YB; The evidence for increased L1 activity in the site of human adult brain neurogenesis (2015) PLoS One; 10(2):e0117854. doi: 10.1371/journal. pone.0117854
2. A. A. Minervina, A. Komkov, A. Kurnosov, V. Nazarov, M. Pogorelyy, E. Kovalenko, K. Khodosevich, I. Mamedov, Y. Lebedev; A novel normalization based approach for somatic Alu insertions identification in human brain cells; , FEBS Journal 282 (Suppl. 1) (2015) 56–408
3. Минервина АА, Комков АЮ, Мамедов ИЗ, Лебедев ЮБ «Усовершенствованная методика детекции опухолевых лимфобластов при Т-клеточных лейкозах»; Доклады академии наук; 2016; том 467, №1, с 105-108.
4. VI Nazarov, AA Minervina, AY Komkov, MV Pogorelyy, IV Zvyagin, MA Maschan, YV Olshanskaya, DM Chudakov, YB Lebedev and IZ Mamedov (2016) Reliability of immune receptor rearrangements as genetic markers for the minimal residual disease monitoring Bone Marrow Transplantation 00, 1–3.
5. A. Komkov, A. Minervina, M. Pogorelyy, I. Zvyagin, A. Panferova, Y. Olshanskaya, D. Chudakov, M. Maschan, I. Mamedov, Y. Lebedev. Next generation sequencing based approach for monitoring of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. FEBS J. 2016; 283 (Suppl.1): 376.
6. A. A. Minervina , A. Y. Komkov, A. A. Kurnosov, V. I. Nazarov, M. V. Pogorelyy, K. V. Khodosevich, I. Z. Mamedov, Y. B. Lededev. Somatic retroelement insertions identification by the new normalization-based method. Eur J Hum Genet. 2016; 24(Suppl.1):355.
7. A Yu Komkov, AM Miroshnichenkova, Yu Olshanskaya, N Myakova, Yu Yu Diakonova, AA Minervina, IZ Mamedov, Yu B Lebedev, AA Maschan, MA Maschan Detection of immunoglobulin genes rearrangements in patients with acute lymphoblastic leukemia using highthroughput next generation sequencing, Gematologiya i transfuziologiya, 2016
8. A Komkov, A Miroshnichenkova, A Minervina, G Nugmanov, Y Lebedev, I Mamedov, Y Olshanskaya, M Maschan; High-throughput sequencing for diagnostics of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia; Klinische Pädiatrie, V.229, Issue 03, p. A42
9. A. Komkov, A. Miroshnichenkova, A. Minervina, G. Nugmanov, Y. Lebedev, Y. Olshanskaya, I. Mamedov, M. Maschan. High-throughput sequencing of immunoglobulin genes rearrangements for diagnostics of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. FEBS J. 2017; 284(Suppl.1):262.
Тезисы конференций:
1. ; Разработка тест-системы для мониторинга минимальной остаточной болезни при острых и хронических лейкозах // Осенний финал по программе "У. М.Н. И.К." РАН - 13.11.2015 - Москва, 2015 - Сборник тезисов - с.21-23.
доклад
2. Минервина АА, Комков АЮ, Назаров ВИ, Звягин ИВ, Мамедов ИЗ, Лебедев ЮБ; Разработка тест-системы для мониторинга минимальной остаточной болезни с использованием высокопроизводительного секвенирования; XXVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»; Сборник тезисов – с. 179
3. Ilgar Mamedov, Alexander Komkov, Anastasia Minervina, Alexey Kurnosov, Vadim Nazarov, Mikhail Pogorelyy, Elena Kovalenko, Sergey Salozhin, Konstantin Khodosevich, Yuri Lebedev; Investigation of somatic AluYa5 insertion frequency in human brain tissues; EMBO | EMBL Symposium: The Mobile Genome: Genetic and Physiological Impacts of Transposable Elements, p. 149, EMBL Advanced Training Centre, Hedidelberg, Germany 16-19 September
4. Alexander Komkov, Anastasia Minervina, Vadim Nazarov, Mikhail Pogorelyy, Alexey Kurnosov, Konstantin Khodosevich, Ilgar Mamedov, Yuri Lebedev; A new normalization-based method for identification and quantification of somatic Alu retroelement insertions; EMBO | EMBL Symposium: The Mobile Genome: Genetic and Physiological Impacts of Transposable Elements, p.137, EMBL Advanced Training Centre, Hedidelberg, Germany 16-19 September
5. , , , ; Система детекции минимальной остаточной болезни при онкогематологических заболеваниях человека на основе технологий массированного секвенирования; Успехи молекулярной онкологии, том 2, 74-75, 2015 РИНЦ
6. Komkov A., Minervina A., Nugmanov G., Nazarov V., Khodosevich K., Mamedov I., Lebedev Y. Normalisation based method for deep sequencing of somatic retroelement integrations in human genome. Retrovirology. 2016; 13(Suppl.1): 68. Scopus
7. , , Ю; Первичная диагностика перестроек иммуноглобулиновых генов опухолевых клонов при гемобластозах методом высокопроизводительного секвенирования; Успехи молекулярной онкологии, том 3, 123, 2016 РИНЦ
8. , , , ; Метод мониторинга минимальной остаточной болезни при острых лимфобластных лейкозах на основе технологий массированного секвенирования; Успехи молекулярной онкологии, том 3, 95, 2016
Тема работы: Создание и тестирование технологии HLA типирования высокого разрешения, основанной на секвенировании нового поколения
Краткое содержание проекта:
Определение аллельных вариантов локуса генов главного комплекса гистосовместимости (MHC - англ. Major Histocompatibility Complex, HLA типирование) играет важную роль в современной медицинской практике особенно при диагностики заболеваний и трансплантациях. Показана ассоциация определенных аллельных вариантов генов HLA локуса с примерно 100 различными патологиями, в том числе с такими заболеваниями как анкилозирующий спондилит, сахарный диабет I типа, болезнь Крона, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и т. д.. Совместимость по HLA антигенам между донором и реципиентом определяет возможность трансплантации, а точность типирования непосредственно влияет на вероятность развития реакции отторжения. В мире высокоточное HLA типирование перешло в ряд рутинной процедуры, однако в России такой анализ провести гораздо сложнее. Широко используемые в нашей стране методики определения генотипов HLA - SSOP и SSP использующие аллель специфические ПЦР, или SBT основанные на секвенировании по методу Сэнгера, не могут обеспечить быстрое типирование большого количества образцов с нужным разрешением. Современные технологии, основанные на высокопроизводительном секвенировании на платформе Illumina позволяют проводить единовременное типирование 20-50 образцов, но их применение весьма ограничено из-за высокой стоимости коммерческих наборов и сложности приготовления библиотек.
Целью настоящего проекта является создание отечественной системы HLA типирования с высоким разрешением с использованием секвенирования нового поколения на платформе Illumina. Выбор РНК, а не ДНК в качестве исходной молекулы для приготовления библиотек, позволит с одной стороны существенно снизить необходимые объемы секвенирования, а с другой стороны получить всю необходимую информацию о HLA аллелях, нужную для поиска совместимого донора. Разрабатываемая методика может быть адаптирована под 96-луночный формат, что дает возможность значительной автоматизации пробоподготовки с использованием лабораторных роботов. Создание такой системы определения HLA генотипов существенно снизит время и стоимость типирования реципиентов и доноров для трансплантаций и поможет в создании Российского регистра доноров костного мозга. Кроме того, широкая доступность системы позволит использовать ее для определения рисков развития, ассоциированных с HLA локусом заболеваний в повседневной медико-диагностической практике.
Календарный план
Первый год
1. Доработка имеющейся системы праймеров для амплификации участков кДНК аллелей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB, HLA-DQB
2. Оптимизация условий пробоподготовки (выделение РНК, кДНК синтез, мультиплексная ПЦР) для получения репрезентативных библиотек кДНК HLA аллелей.
3. Получение кДНК библиотек для 10 доноров и их секвенирование на платформе Illumina MiSeq
4. Разработка биоинформатического алгорима для обработки данных секвенирования и получение на его основе HLA генотипов для 10 доноров
Ожидаемые результаты первый год.
На первом этапе работы планируется получить систему праймеров, позволяющую эффективно амплифицировать участки различных HLA аллелей. Система праймеров будет разработана с учетом высокой вариабельности HLA локусов в человеческой популяции, а также с учетом особенностей секвенирования на платформах Illumina. Также будет выработан и оптимизирован рабочий протокол пробоподготовки кДНК библиотек из образцов цельной крови. Для проверки системы будут получены библиотеки для 10 доноров, а также разработан принцип биоинформатического анализа для получения аллелей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB, HLA-DQB из сырых данных секвенирования. К концу первого года будут определены HLA генотипы с высоким разрешением для 10 доноров.
Второй год
1. Верификация разработанной технологии на образцах РНК пациентов (не менее 15), для которых было проведено типирование HLA при помощи одной из сертифицированных систем (Gold-SSP, GeneDX, Illumina TruSight)
2. Написание набора функций для автоматизированной обработки данных секвенирования с целью получения списка аллелей для каждого донора
3. Использование полученной системы для определения ассоциированных с заболеванием HLA-гаплотипов у детей с высоким семейным риском развития диабета I типа
Ожидаемые результаты второй год.
На втором этапе выполнения проекта с помощью разработанной технологии планируется получение не менее 15 библиотек кДНК для доноров с известными аллелями HLA. После сравнения результатов будут получены такие важные характеристики системы, как точность и глубина типирования. Для автоматизации последующей обработки данных массированного секвенирования будет создан обновляемый R-пакет, содержащий все необходимые функции для осуществления процесса типирования. Скрипт будет принимать на вход сырые данные секвенирования и в качестве выдачи давать таблицу аллелей для каждого из доноров. Полученная система, будет использована для определения HLA-гаплотипов у 50 детей с повышенным семейным риском развития диабета I типа. Для каждого из пациентов будет выявлены наличие ассоциированных с заболеванием, либо защитных HLA-аллелей для более точного определения группы риска.
