ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА G, А и М к Ureaplasma urealyticum
“Уреаплазмоз - IgG/ IgА/ IgМ - антитела”
Настоящая инструкция распространяется на - тест-систему иммуноферментную, предназначенную для выявления индивидуальных антител класса G, А и М к Ureaplasma urealyticum методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе.
Набор состоит из 10 реагентов:
1. Иммуносорбент - планшет с иммобилизированным антигеном Ureaplasma urealyticum
2. К+(IgG/IgA/IgМ) - положительный контрольный образец – инактивированная сыворотка крови человека, содержащая антитела классов G, А и М к Ureaplasma urealyticum - прозрачная жидкость красного цвета;
3. К- отрицательный контрольный образец инактивированная сыворотка крови человека, не содержащая специфических антител к Ureaplasma urealyticum– прозрачная, слегка опалесцирующая, жидкость желтого цвета;
4. Кг - IgG- конъюгат моноклональных антител мыши к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена– прозрачная опалесцирующая жидкость желтого цвета;
5. Кг - IgA - конъюгат моноклональных антител мыши к IgA человека, конъюгированных с пероксидазой хрена– прозрачная опалесцирующая жидкость зеленого цвета;
6. Кг - IgМ - коньюгат моноклональных антител мыши к IgM человека. коньюгированных с пероксидазой хрена - прозрачная жидкость синего цвета
7. РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток – прозрачная опалесцирующая жидкость синего цвета;
8. РБР-К - разводящий буферный раствор для коньюгата - жидкость зеленого цвета;
9. РПР-С - раствор для предварительного разведения сывороток - прозрачная жидкость светло-коричневого или коричневого цвета
10. ФСБ-Тх25 - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином– прозрачная, слегка опалесцирующая, бесцветная жидкость;
11. БРС- буферный раствор для разведения хромогена - прозрачная бесцветная жидкость
12. ТМБ - хромоген – тетраметилбензидин - бесцветная или светло-желтого цвета жидкость;
13. Стоп-реагент – прозрачная бесцветная жидкость.
. Тест-система рассчитана на 96 определений, включая контрольные образцы.
Назначение
Тест-система предназначена как для выявления индивидуальных специфических антител класса G или класса А или класса М, так и для одномоментного выявления антител IgG, IgA, IgМ к антигенам Ureaplasma urealyticum в сыворотке (плазме) крови человека и может быть использована в клинических и эпидемиологических исследованиях, а также службой крови для выявления носителей Ureaplasma urealyticum (с подтверждением другими методами).
Способ применения
1. Приготовление реагентов и исследуемого материала
1.1 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т
При наличии во флаконе с ФСБ-Т осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре (37±1) °С до полного растворения солей.
Содержимое одного флакона с концентратом ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 л и довести объем раствора до 650 мл водой дистиллированной.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора при температуре
от 2 до 8 °С, раствор ФСБ-Т – в течение месяца при температуре от 2 до 8 °С.
При использования одного или нескольких стрипов планшета необходимое количество ФСБ-Т готовиться в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
Количество используемых стрипов | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
Объем, мл | Концентрат ФСБ-Т, мл | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 26 |
Вода дистил-лированная, мл | до 50 | до 100 | до 150 | до 200 | до 250 | до 300 | до 350 | до 400 | до 450 | до 500 | до 550 | до 650 |
1.2 Подготовка БРС, РБР-С, РБР-К, РПР-С, К+, К-, стоп-реагента
БРС, РБР-С, РБР-К, РПР-С, К+, К-, стоп-реагент– готовы к использованию
Хранение: неиспользованные БРС, РБР-С, РБР-К, РПР-С, К+, К-, стоп-реагент - хранят в течение срока годности набора при температуре от 2 до 8 °С.
1.3 Подготовка рабочего раствора ТМБ
ТМБ разводят в БРС в соотношении 1:20. В зависимости от количества используемых стрипов необходимые объемы ТМБ и БРС указаны в таблице 2.
Таблица 2
Количество используемых стрипов | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
Объем, мл | Концентрат ТМБ, мл | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0.35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | 0,55 | 0,6 |
БРС, мл | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1.4 Подготовка рабочих растворов коньюгатов Кг - IgG, Кг - IgA, Кг - IgМ
1.4.1 Подготовка рабочего раствора коньюгата Кг - IgG
В зависимости от количества используемых стрипов коньюгат разводить в РБР-К в соответствии с таблицей 3
Таблица 3 Серия 11
Количество используемых стрипов | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
Объем, мл | Кг - IgG, мл | 0,020 | 0,040 | 0,060 | 0,080 | 0,100 | 0,120 | 0,140 | 0,160 | 0,180 | 0,200 | 0,220 | 0,240 |
РБР-К, мл | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1.4.2 Подготовка рабочего раствора коньюгата Кг - IgА
В зависимости от количества используемых стрипов коньюгат разводить в РБР-К в соответствии с таблицей 4
Таблица 4
Количество используемых стрипов | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
Объем, мл | Кг - IgА, мл | 0,030 | 0,060 | 0,090 | 0,120 | 0,150 | 0,180 | 0,210 | 0,240 | 0,270 | 0,300 | 0,330 | 0,360 |
РБР-К, мл | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
1.4.3 Подготовка рабочего раствора коньюгата Кг - IgМ
В зависимости от количества используемых стрипов коньюгат разводить в РБР-К в соответствии с таблицей 5
Таблица 5
Количество используемых стрипов | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
Объем, мл | Кг - IgМ, мл | 0,013 | 0,026 | 0,039 | 0,052 | 0,065 | 0,078 | 0,091 | 0,104 | 0,117 | 0,130 | 0,143 | 0,156 |
РБР-К, мл | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
2. Подготовка исследуемых сывороток
Для анализа можно использовать сыворотку (плазму) крови человека как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 24 ч при температуре от 2 до 8° С или в течение трех месяцев при температуре минус 20 °С. Для проведения анализа использовать образцы сыворотки или плазмы крови человека объемом не менее 50 мкл.
Скрининг исследуемых сывороток проводят в разведении 1:100. Для этого готовится предварительное разведение исследуемых сывороток 1:10,т. е. в лунки вспомогательного планшета(в набор не входит) вносят по 90 мкл РПР-С и по 10 мкл исследуемых сывороток.
Тщательно перемешивают пипетированием, при этом РПР-С меняет цвет.
3. Проведение ИФА
Комплект перед проведением анализа выдержать в течение 30 мин при температуре от 20 до 25° С.
3.I. Выявление антител класса IgG
3.1.1. Для внесения контрольных сывороток можно использовать любые лунки планшета. Для этого в одну лунку внести 100 мкл К+(IgG/IgA/IgМ), в две другие лунки планшета - по 100 мкл К-. В остальные лунки планшета внести по 90 мкл РБР-С. Одну лунку с РБР-С оставить для контроля конъюгата.
При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать для К - и К+ - по одной лунке.
В остальные лунки планшета с РБР-С внести по 10 мкл исследуемых предварительно разведенных сывороток. Раствор перемешать пять раз пипетированием. Таким образом, исследуемые сыворотки при скрининге разбавляются в 100 раз
После этого планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (37±1) 0С.
3.1.2. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз с помощью автоматического промывателя или в ручную, при этом в каждую лунку планшета вноситься не менее 250 мкл раствора в процессе одного промывания. Время между заполнением и опорожнением должно быть не менее 10 сек, по окончанию промывки остатки жидкости удалить, активно постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге. Фильтровальную бумагу желательно использовать однократно.
3.1.3. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата против иммуноглобулинов G человека. Планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (37±1)° С.
3.1.4. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.2
I3.1.5. Внести в каждую лунку планшета по 100 мкл рабочего раствора ТМБ.
Планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой и поместить на 15 мин в защищенное от света место при температуре (37±1)° С.
3.1.6. Реакцию остановить внесением в каждую лунку планшета по 50 мкл стоп-реагента.
3.2 Выявление антител класса IgA
Анализ образцов проводить так же, как и для выявления антител класса IgG, только вместо коньюгата Кг - IgG использовать коньюгат Кг - IgА (приготовление см. в таблице 4)
3.3 Выявление антител класса IgМ
Анализ образцов проводить, как и для антител класса IgG, только вместо коньюгата Кг - IgG использовать коньюгат Кг - IgМ (приготовление см. в таблице 5)
4. У ч е т р е з у л ь т а т о в
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень («бланк») задают по воздуху. Результаты учитывают только в том случае, если если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОПкк) не превышает 0,15,
значение ОП в лунках с К - среднее значение ОП (ОПК-) не более 0,2, в лунках с К+(IgG/IgA/IgМ)) среднее значение ОП (ОПК+) не менее 1,0.
Рассчитывают ОПкрит. по формуле:
Для IgG и IgA ОПкрит = ОПК – (ср.) +0,25
Для IgM ОПкрит. = ОПК-(ср.) + 0,2,
где ОПК-(ср.) – среднее значение ОП (ОПК-) по двум лункам.
Если значение оптической плотности исследуемого образца ОПиссл. < 0,9хОПкрит, то результат анализа считают отрицательным. Если ОПиссл. попадает в интервал от 0,9xОПкрит до 1,2xОПкрит, то результат анализа сомнительный. Рекомендуется повторить анализ такой сыворотки. Если ОПиссл. > 1,2xОПкрит, то результат анализа исследуемого образца считают положительным.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
А) для выявления антител класса IgG
Оптическая плотность сыворотки | Результат | Приблизительный титр IgG |
От 0 до ( ОПкрит –0,05) | отрицательный | Менее 100 |
От (ОПкрит-0,05) до ОПкрит | сомнительный | 100 |
От ОПкрит до (ОПкрит+0,05) | слабоположительный | 100 |
От (ОПкрит+0,05) до 2хОПкрит | положительный | 200 |
Более 4хОПкрит | сильноположительный | Более 200 |
При визуальной оценке результатов отрицательными считаются пробы бледно-желтого цвета или бесцветные как и для К-, положительными – пробы желтого или ярко-желтого цвета.
При положительных результатах с сыворотками в разведении 1:100 при необходимости проводят их дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений раствором РПР-С.
Титром сыворотки считается последнее разведение сыворотки, ОП которого превышает ОПкрит.
Для постановки окончательного диагноза рекомендуется исследование на наличие возбудителя уреаплазмоза методом ИФА или ДНК уреаплазмоза методом ПЦР. Совокупность результатов ИФА, ПЦР, клиники и эпидемиологии инфекции позволяет ставить окончательный диагноз на наличие инфекции.
Б) для выявления антител класса IgM
Положительными считаются те исследуемые сыворотки, ОП которых превышает ОПкрит.
При положительных результатах с сыворотками в разведении 1:100 при необходимости проводят их дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений раствором РПР-С.
Титром сыворотки считается последнее разведение сыворотки, ОП которого превышает ОПкрит.
Для постановки окончательного диагноза рекомендуется исследование на наличие возбудителя уреаплазмоза методом ИФА или ДНК уреаплазмоза методом ПЦР. Совокупность результатов ИФА, ПЦР, клиники и эпидемиологии инфекции позволяет ставить окончательный диагноз на уреаплазмоз
В) для выявления антител класса IgА
Положительными считаются те исследуемые сыворотки, ОП которых превышает ОПкрит.
При положительных результатах с сыворотками в разведении 1:100 при необходимости проводят их дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений раствором РПР-С.
Титром сыворотки считается последнее разведение сыворотки, ОП которого превышает ОПкрит.
Для постановки окончательного диагноза рекомендуется исследование на наличие возбудителя уреаплазмоза методом ИФА или ДНК уреаплазмоза методом ПЦР. Совокупность результатов ИФА, ПЦР, клиники и эпидемиологии инфекции позволяет ставить окончательный диагноз на уреаплазмоз
5. Форма выпуска
Тест-систему выпускают в виде набора, упакованного в коробку из картона, куда вкладывают инструкцию по применению.
Набор состоит из следующих компонентов: иммуносорбент, запаянный в пластиковый пакет, – 1 шт.; ФСБ-Т по 26 мл - 1 флакон; РБР-С по 11 мл - 1 флакон; РБР-К - 13мл, 1 флакон; Кг - IgG - 0,35мл, 1 флакон; Кг-IgA - 0,5мл, 1 флакон; коньюгат Кг - IgМ – 0,2 мл, 1 флакон; К+ (IgG/IgA/IgМ) - 1,5 мл, 1 флакон;
К- - 1,5 мл, 1 флакон; РПР-С по 13мл. – 1флакон, ТМБ- 0,7мл, 1флакон; БРС - 13 мл, 1 флакон; стоп-реагент - 6 мл, 1 флакон.
6. Срок годности, условия хранения и транспортирования
Срок годности набора 9 месяцев.
Хранение при температуре от 2 до 8° С.
Транспортирование производить при температуре от 2 до 8° С. Допускается транспортирование при температуре не выше + 27 °С в течение 10 дней.
Не допускать замораживания.
Рекламации на специфические и физические свойства тест-системы направлять в ООО “ИмДи-спектр” (630559, Новосибирская область, Новосибирский р-н, пгт. Кольцово, а/я 172
тел./
