Фенотипические и генетические маркеры холодовой адаптации вируса краснухи (стр. 2 )

Реакция нейтрализации

Реакцию нейтрализации проводили с использованием реакции ЦПД в культуре клеток RK-13. Готовили разведения иммунной сыворотки и добавляли равный объем ВСЖ с титром вируса 3 lgТЦД50/мл. Учитывали предельное разведение сыворотки, при котором не наблюдается ЦПД вируса.

Определение IgG антител к вирусу краснухи методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Определение IgG антител кролика к вирусу краснухи проводили с помощью набора «Векто-Рубелла – IgG» «Вектор-Бест» (Россия) по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Сыворотки разводили 1:100, связавшиеся антитела выявляли при инкубации с конъюгатом козьих антикроличьих IgG антител «Sigma Aldrich» (США) с пероксидазой хрена. Результаты учитывали на приборе Anthos Zenith 3100 «Anthos Labtec Instruments GmbH» (Австрия).

Выделение вирусной РНК

Вирусную РНК из исследуемых и контрольных образцов выделяли с помощью наборов реагентов «ZR Viral RNA Kit» (Zymo Research, США) или «Viral RNA Mini Kit» (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Выделение РНК проводили из 100 мкл ВСЖ, элюцию – в 60 мкл безнуклеазной воды. Образцы РНК хранили при -70°С до постановки реакции ОТ и ПЦР.

Реакция обратной транскрипции

При постановке реакции обратной транскрипции (ОТ) 2 мкл праймера (5 пмоль/мкл) смешивали с 5 мкл вирусной РНК и прогревали смесь при 65ºC в течение 5 минут. кДНК получали в 30 мкл реакционной смеси, содержащей помимо праймера и РНК, буфер для ОТ, 0.5 мМ дНТФ, 2.5 мМ MgCl2, 4 ед. ингибитора рибонуклеаз, 50 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони «RevertAid H Minus M-MuLV» (Fermentas, Литва) (табл. 2). Смесь инкубировали в течение 30 минут при 42°C. Фермент инактивировали нагреванием при 95°C в течение 5 минут.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР проводили в амплификаторе «Циклотемп» (Россия). Реакцию проводили с использованием набора реактивов для проведения ПЦР-РВ (Буфер Б) (Синтол, Россия) или, при амплификации GC-богатых фрагментов, набора «TaKaRa LA with GC buffer» (Takara, Япония) в объеме 25 мкл для аналитических целей и 50-100 мкл для препаративных целей по протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Филогенетический анализ и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Нуклеотидные последовательности штаммов вируса краснухи были получены из электронной базы данных GenBank (NCBI). Анализ нуклеотидных последовательностей, множественное выравнивание геномов вирусов для выявления консервативных последовательностей, подбор праймеров и зонда для ОТ, ПЦР-РВ и секвенирования, генотипирование штамма вируса краснухи С-77 проводили с помощью компьютерных программ Omiga 2.0 («Oxford Molecular Ltd.», США) и Vector NTI Advance 9.0 («InforMax Inc.», США), FinchTV 1.4 (США), Unipro UGENE 1.7.0 (Россия).

Количественное определение вируса

Количественное определение ВК методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводили по методике, разработанной с соавторами [, 2010].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ температурной чувствительности штаммов вируса краснухи

В процессе аттенуации вакцинные штаммы вируса краснухи приобретают ряд фенотипических отличий от диких штаммов. Одним из важнейших фенотипических маркеров аттенуации является наличие ca - фенотипа, т. е. способность эффективно репродуцироваться при пониженной температуре. Аттенуацию всех вакцинных штаммов вируса краснухи проводили при пониженной температуре, в результате чего все они приобрели ca -фенотип [Ohtawara M., 1985]. В данной работе был проведен анализ интенсивности репродукции дикого и холодоадаптированного вариантов штамма С-77, а также вакцинного штамма Wistar RA27/3 в качестве штамма сравнения, при различных температурных режимах с использованием метода количественного определения вируса на основе ПЦР-РВ. Для получения образцов вируссодержащей жидкости культуру клеток Vero заражали вирусом краснухи с множественностью заражения 0.01 инфекционная единица на клетку. Сбор вирусного материала проводили на 3-6 сутки после заражения.

Было установлено, что на пятый день культивирования при 39ºС титр ca46, ca39 вариантов штамма С-77 и штамма Wistar RA27/3 был меньше на 2.6, 2.2 и 1.1 lgТЦД50/мл соответственно, чем при температуре культивирования 33ºС (p<0.01), в то время как у wt варианта не наблюдалось достоверной разницы в титрах вируса при температуре культивирования 33ºС и 39ºС на пятый день (рисунок 1).

Небольшая разница в титре варианта са46 при температуре культивирования 33ºС и 39ºС была более выражена, чем у варианта ca39 (p<0.01), что может быть обусловлено лучшей адаптацией варианта ca46 к пониженной температуре культивирования, т. к. вариант ca39 культивировался при 33ºС 4 пассажа, а вариант ca46 – 11.

Таким образом, была установлена достоверная разница в интенсивности репродукции са39 и ca46 вариантов штамма С-77 при температурах культивирования 33ºС и 39ºС, при отсутствии достоверной разницы для wt варианта (рис. 1), что подтверждает наличие у ca вариантов вируса биологического маркера аттенуации – холодоадаптированного фенотипа. Данный маркер аттенуации может быть использован для дифференцирования ослабленных и диких штаммов вируса краснухи, а также для контроля стабильности вакцинных штаммов при производстве вакцин против краснухи.

Рис. 1. Накопление wt, ca39, ca46 вариантов штамма С-77 и штамма Wistar RA27/3 вируса краснухи в культуральной жидкости на пятый день культивирования при температуре 33ºС и 39ºС. Данные представлены в виде средних значений трех независимых экспериментов

Изучение wt и ca вариантов штамма С-77 в иммунологическом маркерном тесте

Одним из фенотипических маркеров аттенуации вируса краснухи является пониженная иммуногенность на кроликах по сравнению с диким штаммом [Linnemann C. C., 1974]. Для выявления иммунологического маркера аттенуации штамма С-77 вируса краснухи было проведено сравнение антигенных свойств wt, ca39 вариантов штамма С-77, а также вакцинного штамма Wistar RA27/3 при внутривенной иммунизации кроликов.

Применение ИФА позволило выявить развитие сероконверсии вирус-специфических IgG-антител в ответ на введение вируса краснухи. Общий уровень IgG антител был определен перед первичной иммунизацией, а также через три, пять и девять недель после иммунизации (рис. 2). Уже через одну неделю после первичной иммунизации в сыворотке кроликов выявлялись вирусспецифические IgG-антитела к вирусу краснухи. Было выявлено, что наибольшей антигенностью обладают ca39 и wt варианты штамма С-77, у которых наблюдался высокий уровень антител, начиная с третьей недели после иммунизации, в то время как у штамма Wistar RA27/3 уровень антител был значительно ниже (рис. 2).

Рис. 2. Уровень IgG антител при первичной иммунизации кроликов wt, ca39 вариантами штамма С-77 и штаммом RA27/3, установленный методом ИФА. Титр вируса, использованный для иммунизации, – 3 lgТЦД50/мл, разведение сывороток 1:100.

В этих же сыворотках был определен титр вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. Уже на первой неделе после первичной иммунизации наблюдался рост титра антител к wt варианту штамма C-77, который достигал максимальных значений 1:32 на 3-9 неделях. Титр антител к ca39 варианту штамма С-77, а также к штамму RA27/3 был значительно ниже, что согласуется с классическим испытанием Линнеманна на иммуногенность ослабленных штаммов. Максимальный титр ca39 варианта на пятой неделе составил 1:8, штамма Wistar RA27/3 – 1:4 на третьей неделе. На девятой неделе титр вируснейтрализующих антител к вакцинному штамму Wistar RA27/3 и са39 падал до 1:2, тогда как титр антител к дикому варианту штамма С-77 оставался на высоком уровне (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о существенных иммунологических различиях между диким и холодоадаптированными вариантами штамма С-77. Уровень протективных антител к холодоадаптированным штаммам краснухи был достоверно ниже. Наблюдалась достоверная разница в титре антител к ca39 варианту и штамму RA27/3, что говорит о более высокой антигенности штамма С-77 для кроликов. Таким образом, с помощью иммунологического маркерного теста у ослабленного и холодоадаптиарованного варианта штамма С-77 выявлен иммунологический маркер аттенуации. Наряду с холодоадаптированным фенотипом данный маркер аттенуации может быть использован на производстве для контроля стабильности вакцинных штаммов.

Рис. 3. Титр вируснейтрализующих антител у кроликов при первичной иммунизации wt, ca39 вариантами штамма С-77 и штаммом RA27/3. Титр вируса, использованный для иммунизации, – 3 lgТЦД50/мл.

Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности генома дикого и аттенуированного вариантов ВК (штамм С-77)

С целью выявления вероятных генетических детерминант холодовой адаптации было проведено полное секвенирование генома wt и ca39 вариантов штамма С-77 вируса краснухи. При секвенировании геномов wt и ca вариантов штамма С-77 были определены все кодирующие последовательности, важные для оценки роли конформационных изменений вирусных белков.

Несмотря на существование только одного серотипа вируса краснухи и высокую консервативность генома, генотипирование выделенных штаммов является важной задачей эпидемиологии. Генотипирование штаммов вируса краснухи, выделенных у пациентов, служит для оценки эффективности элиминации краснухи, а также оценки реальных источников инфекции [WHO Expert Committee on Biological Standardization Technical Report Series No 941 2007]. С целью генотипирования штамма вируса краснухи С-77 был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих ген Е1 размером 1442 нуклеотида (8256-9698) wt варианта вируса, в результате которого штамм вируса краснухи С-77 был отнесен к генотипу 1h. Параллельно, в качестве контроля, проводили секвенирование участка генома Е1 вакцинного штамма RA27/3: полученная нами последовательность на 100% совпала с уже известной (код в GenBank - FJ211588).