Фенотипические и генетические маркеры холодовой адаптации вируса краснухи (стр. 1 )

На правах рукописи

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

ХОЛОДОВОЙ АДАПТАЦИИ ВИРУСА КРАСНУХИ

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. ” Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

, член-корреспондент РАМН и РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ вирусологии имени » Минздравсоцразвития России, заместитель директора по научной работе,

, доктор биологических наук, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», заместитель директора по научной работе.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени » Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится 20 декабря 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. » РАМН г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. » РАМН.

Автореферат разослан «___» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Краснуха – острое вирусное заболевание, широко распространенное как у детей, так и у взрослых. Вакцинация является наиболее эффективным, экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В России вакцинация против краснухи введена в календарь прививок с 1998 г. Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что сохраняет угрозу появления случаев синдрома врожденной краснухи (СВК). В связи с этим проблема профилактики СВК в настоящее время является весьма актуальной. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используется вакцина зарубежного производства, созданная на основе штамма Wistar RA27/3 и впервые зарегистрированная в Европе в 1971 г. [Plotkin S. A., 1976]. Для проведения широкомасштабной вакцинации в России и снижения издержек на закупку зарубежной вакцины требуется создание вакцины, основанной на отечественном вакцинном штамме.

С учетом массовости и повторности прививок против этой инфекции важны надлежащее качество применяемых вакцин и их низкая реактогенность. Особое значение имеет контроль генетической стабильности вакцинных штаммов. Такой контроль необходим, так как в процессе производства вакцин возможно накопление в геноме вакцинного вируса мутаций, способных привести к снижению или потере иммуногенных свойств вследствие гиператтенуации, а также к реверсии аттенуированного вируса к дикому штамму. Согласно рекомендациям ВОЗ, в особенности, для живых аттенуированных вакцин, следует проводить контроль генетической стабильности, поиск генетических маркеров аттенуации и подтверждение их наличия в вакцинных штаммах [WHO, Technical Report Series No 941, 2007; WHO Technical Report, Series №. 924 2004].

Механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью, поэтому актуальным является изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось выявление фенотипических и генетических детерминант аттенуации вируса краснухи на примере штамма С-77.

Для реализации поставленной цели требовалось решение следующих задач:

§  биологическая характеристика дикого и ослабленного вариантов штамма С-77 вируса краснухи и выявление фенотипических детерминант его аттенуации;

§  подбор праймеров для секвенирования генома вируса краснухи и оптимизация условий проведения ПЦР;

§  определение генотипа штамма С-77 вируса краснухи;

§  полноразмерное секвенирование генома дикого и холодоадаптированного (wt и ca) вариантов штамма С-77 вируса краснухи;

§  сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей wt и ca вариантов штамма С-77 вируса краснухи и поиск вероятных генетических маркеров его аттенуации.

Научная новизна работы

Впервые в России осуществлен анализ геномов дикого и холодоадаптированного вариантов (ca и wt варианты) вируса краснухи. Было проведено сравнение последовательностей геномов ca и wt вариантов штамма С-77, а также других известных последовательностей геномов вируса краснухи. На основании этого сравнения были установлены вероятные генетические маркеры аттенуации, согласующиеся с современными представлениями о механизмах аттенуации вируса краснухи. В частности, была обнаружена аминокислотная замена в позиции 1042 домена, кодирующего протеазу, которая играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca варианта штамма С-77. С использованием современных вирусологических, иммунохимических и молекулярно-биологических методов установлены фенотипические маркеры аттенуации холодоадаптированного варианта штамма С-77 вируса краснухи.

Практическая значимость работы

Отработанные методические приемы выявления генетических и фенотипических маркеров аттенуации вируса краснухи, выявленные генетические и фенотипические маркеры аттенуации штамма С-77 могут быть использованы в научных исследованиях, а также для контроля вакцинных штаммов на производстве, разработки и характеристики новых вакцинных штаммов вируса краснухи.

Полученные в работе данные о механизмах аттенуации вируса краснухи могут быть использованы при разработке вакцинных препаратов.

Вариант штамма С-77 на 39 пассаже обладает биологическими маркерами аттенуации: пониженной иммуногенностью на кроликах по сравнению с диким вариантом и холодоадаптированным фенотипом, что позволяет рассматривать его в качестве кандидата для разработки на его основе отечественной вакцины.

Положения, выносимые на защиту

  1. Варианты штамма С-77 вируса краснухи на 39 и 46 пассажах обладают холодоадаптированным фенотипом, то есть способны к эффективной репродукции при пониженной температуре.

  2. Сa и wt варианты штамма С-77 обладают фенотипическими различиями, выражающимися в сниженной иммуногенности на кроликах и более интенсивной репродукцией холодоадаптированного варианта штамма С-77 при пониженной температуре по сравнению с диким вариантом.

  3. В процессе холодовой адаптации штамма С-77 в геноме вируса произошло 13 нуклеотидных замен, 6 из которых вели к замене аминокислот. Часть из них уникальна и, возможно, определяет фенотипические отличия дикого и холодоадаптированного штамма.

  4. Большая часть аминокислотных замен локализована в области, кодирующей неструктурные белки, в частности, протеазу и представляют особый интерес, так как мутации в этом регионе, по данным литературы, приводят к возникновению холодоадаптированного фенотипа и связаны с аттенуацией вируса краснухи. Замена Tyr на Cys в позиции 1042 ОРС НСБ области, кодирующей протеазу, играет ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа ca варианта штамма С-77.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2010 г.), конференции молодых ученых «НИИВС им » РАМН (Москва, 2011 г.), 11-ом международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011 г.).

Апробация диссертации состоялась 07.06.2012 г. на научной конференции отдела вирусологии им. ФГБУ «НИИВС им. » РАМН.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 источника, из которых 11 отечественных и 125 зарубежный. Работа выполнена на 123 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Вирусный материал

В работе был использован отечественный штамм вируса краснухи С-77, выделенный из носового смыва больного манифестной формой краснухи в 2001 г. (wt). Также в работе использовались два холодоадаптированных (ca ) варианта штамма С-77 на 39 и 46 пассаже. Для их получения дикий вариант длительно культивировался в культуре клеток Vero: 34 пассажа при температуре 35ºС и 4 и 11 пассажей при 33ºС соответственно.

Клеточные линии

Перевиваемые культуры клеток почки кролика (линия RK-13) и африканской зеленой мартышки (линия Vero) были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Перевиваемые клеточные линии RK-13 и Vero культивировали в питательных средах RPMI 1640 (Gibco, США) или MEM (Gibco) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hy Clone, США), 1мМ глутамина (Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco) в T175 см2 матрасах, (Greiner Bio-one, Германия) при +37°С и 5%СО2.

Тест на иммуногенность

Антигенные свойства вариантов штамма С-77 (wt, ca39, ca46 вариантов) и штамма Wistar RA27/3 изучали с использованием иммунологического маркерного теста на кроликах. Для постановки теста использовали самок кроликов породы «шиншилла» весом 2,5-3 кг. Каждый штамм испытывался на двух животных. Вируссодержащую жидкость (ВСЖ) вводили по 1,0 мл внутривенно. Титр вируса составлял 3 lgТЦД50/мл. Сыворотки крови исследовали в реакции нейтрализации и ИФА.