УДК 577-1+547-9.
Взаимодействие D-лактозы с ароматическими аминами
в водно-этанольной среде
© Черепанов+* Игорь Сергеевич, Абдуллина Гулямза Миннулловна,
Кафедра фундаментальной и прикладной химии. Удмуртский государственный университет. Ул. Университетская, 1. г. Ижевск, 426034. Удмуртская Республика. Россия.
Тел.: (3412)916-437. E-mail: cherchem@mail.ru.
_______________________________________________
*Ведущий направление; +Поддерживающий переписку
Ключевые слова: D-лактоза, ароматические амины, «браун»-реакции, N-ариллактозиламины, меланоидины.
Аннотация
Представлены результаты по изучению взаимодействия D-лактозы с замещенными ароматическими аминами, в частности с п-аминобензойной кислотой и п-толуидином. Показано, что на первой стадии образуются соответствующие N-ариллактозиламины, при этом оптимальными растворителями для их синтеза определены смешанные водно-спиртовые составы с содержанием этанола 60-65%. Методами спектрофотометрии и ИК-спектроскопии установлено, что формирование меланоидинов из N-п-толиллактозиламина в процессе его кислотно-каталитической деструкции протекает через образование и деградацию продукта перегруппировки Амадори, существенно менее основный N-п-карбоксифениллактозиламин в изученных условиях значительно более устойчив к изомеризации и меланоидинообразованию. На основании данных спектроскопии сделано предположение о структуре «браун»-продуктов в системе D-лактоза – п-толуидин, определяемой как полимерной, включающей α,α’-дизамещенные фурановые и N-толилпиррольные фрагменты.
Введение
Характерными и важными для восстанавливающих углеводов и их аминоконъюгатов превращениями являются процессы образования окрашенных продуктов или «браун»-реакции, в частности меланоидинообразование и карамелизация. Эти сложные процессы протекают в продуктах питания при их длительном хранении, термической обработке или порче; они также имеют место при производстве и хранении гликозиламинов - лекарственных препаратов.
Лактоза является восстанавливающим дисахаридом, проявляя практически все свойства данного класса веществ, и имеет важное значение для пищевой промышленности, необходима для синтеза цереброзидов и мукополисахаридов в организме человека; ей присуща серологическая и бифидогенная активность, она оказывает остеогенное и гепатозащитное действие [1].
Аминокарбонильные реакции с углеводами могут давать как алифатические, так и ароматические амины и аминокислоты, при этом особый интерес представляют продукты взаимодействия с биологически активными α-аминокислотами, п-аминобензойной и аминосалициловой кислотами и их производными, некоторыми азотистыми гетероциклами. Закономерности взаимодействия лактозы с аминами в процессах гликозирования с образованием аминконъюгатов изучались путем препаративного синтеза замещенных N-ариллактозиламинов [2,3], получения продуктов перегруппировки Амадори (ППА) последних, в частности для определения возможности реализации гидролитического расщепления ППА с образованием лактулозы [1], рассмотрены кинетика и механизмы деградации некоторых конъюгатов лактозы с алифатическими аминокислотами в водных растворах [4], при этом закономерности реакций в смешанных растворителях изучены в существенно меньшей степени [5].
Деструкция лактозы и ее аминопроизводных в растворах при длительном термическом воздействии может протекать по разным направлениям в зависимости от условий [1]. Образование производных может происходить непосредственно при нагревании нейтральных водных растворов лактозы выше 1000С, при этом возможно дальнейшее расщепление молекулы дисахарида с образованием галактозы и раскрытие фруктопиранозного кольца [4]; в присутствии аминов протекает параллельный процесс образования и последующей деградации аминоконъюгатов. Автор обзора [6] определяет глубокую термодеструкцию свободных углеводов (карамелизацию) термодинамически более выгодным процессом, в то время как деградация углеводных аминоконъюгатов (меланоидинообразование) предпочтительнее кинетически.
Целью настоящего исследования является изучение возможных химических взаимодействий и природы их продуктов в системах D-лактоза – п-аминобензойная кислота и D-лактоза – п-толуидин в водно-этанольных средах при повышенных температурах.
Экспериментальная часть
В работе использовалась реактивы марки «чда» и «хч», содержание этанола в водно-спиртовых растворах определялась рефрактометрически, электронные спектры продуктов в растворах регистрировались на спектрофотометре СФ-2000, инфракрасные спектры твердых веществ снимались в таблетках KBr на ИК-Фурье-спектрометре ФСМ 1201.
Получение N-ариллактозиламинов осуществлялось нагреванием при непрерывном перемешивании водно-этанольных растворов (15 мл), содержащих лактозу (0.005 моль) и соответствующий ариламин (0.005 моль) в термостатируемой колбе с обратным холодильником. Конденсация с п-аминобензойной кислотой проводилась в присутствии 0.1 мл уксусной кислоты при 750С, с п-толуидином реакция проводилась при 600С без добавления катализатора в течение заданного времени, при котором достигалось полное растворение реагентов, после чего выдержка составляла 0.5 часа. К охлажденному раствору добавлялся двукратный объем диэтилового эфира, что приводило к выделению кристаллических продуктов, которые впоследствии перекристаллизовывались из горячего этанола.
Изучение процессов меланоидинообразования проводилось для реакционных систем D-лактоза - ариламин эквимолярного состава (0.005 моль) в водно-спиртовой среде (62% EtOH) в условиях кислотного катализа. Исходные реакционные смеси нагревались (800С) при перемешивании в течение 2-2.5 ч в присутствии уксусной кислоты (0.2 мл), через заданные промежутки времени отбирались пробы (0.2 мл), которые разбавлялись в мерных колбах до объема 25 мл водным этанолом, после чего в кварцевых кюветах (l = 2 см) снимались электронные спектры в интервале длин волн 250-650 нм.
Результаты и их обсуждение
На первом этапе работы было изучено образование N-ариллактозиламинов как начальной стадии аминокарбонильных взаимодействий в системах D-лактоза – ариламин. Особенностью препаративных методик конденсации аминов с лактозой является пониженная реакционная способность последней, а также ее низкая растворимость в этаноле, предполагающая использование в качестве реакционной среды водно-спиртовых систем, причем максимальная скорость растворения исходных реагентов и выход лактозиламинов достигаются при содержании этанола равном 60-65%. При дальнейшем увеличении содержания спирта растет количество непрореагировавшей лактозы, не вступающей в реакцию даже при трехчасовом кипячении реакционной смеси. Выходы лактозиламинов в общем случае ниже, чем аминоконъюгатов более активных моносахаридов и составляют в зависимости от условий в среднем около 30-50% [2,7].
N-п-карбоксифениллактозиламин (КФЛА, выход 35%, Тпл = 173-1750С, λmax = 315 нм) и N-п-толиллактозиламин (ТЛПА, выход 30%, Тпл = 140-1420С, λmax = 306 нм) были получены в виде кристаллических порошков светло-желтого цвета, в ИК-спектрах которых регистрируются характерные для углеводных аминоконъюгатов полосы поглощения (1330-1280 см-1 (νC-N), 1605-1590 см-1 (δN-H), 3340-3200 см-1 (νN-H, νO-H), колебания пиранозных колец гликона в области 1100-1000 см-1). В УФ-спектрах спиртовых растворов синтезированных N-ариллактозиламинов фиксируются интенсивные полосы поглощения с существенным вкладом внутримолекулярного переноса заряда в п-дизамещенном арильном фрагменте.
На следующем этапе исследования были изучены более глубокие превращения в исследуемых системах. Образовавшиеся на первой стадии взаимодействия D-лактозы (1) с ариламинами N-гликозиламины (2) могут, как известно, претерпевать кислотно-каталитическую перегруппировку Амадори, приводящую к образованию изомерных дезоксиаминокетоз (3):
Ar ≡ п-толил (1→2→3), п-карбоксифенил (1→2).
Возможность изомеризации N-гликозиламинов определяется донорными свойствами гликозидного азота и для конъюгатов моноз и слабоосновных аминов дезокисаминокетозы с приемлемым выходом не образуются. Данный вывод справедлив и для производных лактозы: нагревание при 85-900С в течение 2.5 часов водно-спиртового раствора КФЛА практически не приводило к образованию дезоксиаминокетозы и получаемый продукт идентифицировался как N-лактозиламин; к выводу о том, что перегруппировка (2) → (3) для слабоосновных гликозиламинов протекает в крайне незначительной степени приходят и другие авторы [3]. Можно также предположить, что в случае образования ППА непосредственно при нагревании исходной реакционной системы D-лактоза – п-аминобензойная кислота (через стадию образования лактозиламина, но без его выделения), впоследствии должны протекать реакции сравнительно быстрой деструкции дезоксиаминокетозы с образованием «браун»-продуктов [4], что может быть зафиксировано спектрофотометрически.
Максимумы поглощения в УФ-спектрах реакционной системы D-лактоза – п-аминобензойная кислота удовлетворительно совпадают с максимумом поглощения КФЛА (рис. 1), а их положение остается практически неизменным на протяжении эксперимента, при этом других полос в видимой области вплоть до 650 нм зафиксировано не было. Характер кривых также не меняется, за исключением профиля первого спектра, на котором четко регистрируется плечо в интервале 306-310 нм, не фиксируемое впоследствии, что, видимо, связано с совместным поглощением на начальном этапе реакции. На последнем интервале измерений температуру повышали до 950С, при этом раствор к моменту окончания эксперимента имел очень слабую окраску.
Рис. 1. Спектры поглощения реакционной системы D-лактоза (0.005 моль) – п-аминобензойная кислота (0.005 моль), регистрируемые при различной продолжительности нагревания (62% EtOH, l = 2 см).
Обусловливающими инертность карбоксифениллактозиламина причинами можно считать отмеченную выше устойчивость N-гликозидного фрагмента к перегруппировке; в пользу такого рода устойчивости дополнительно свидетельствует отсутствие поглощения в области 250-280 нм, отвечающее образованию первичных продуктов деструкции, в частности низкомолекулярных пирролов и пиразинов. Отсутствуют в спектрах поглощения и полосы, характерные для фурфурола и его производных (280-305 нм), что приводит к выводу об устойчивости и О-гликозидного фрагмента в условиях эксперимента; подтверждающемуся имеющимися в литературе данными [5], согласно которым этанол ингибирует образование 5-гидроксиметилфурфурола и продуктов его конденсации из свободных моно - и дисахаридов при недостатке амина в реакционной среде.
Более активный п-толуидин в реакции с лактозой давал окрашенные продукты уже через 30 мин после начала термостатирования, при этом в спектрах растворов (рис. 2) при более длительном нагревании отмечается четкий пик при 304 нм и характерное для меланоидинообразования поглощение в форме плато, включающее два слабых плеча (400 и 480 нм). Первый максимум можно отнести к суммарному поглощению N-толиллактозиламина, продукта его изомеризации и формирующихся олигомерных продуктов конденсации α-замещенных фуранов, последние традиционно определяются как растворимые пре-меланоидины [5,8], при этом наблюдается прямая временная зависимость оптической плотности. Формирование максимумов поглощения в видимой области свидетельствует о постепенном переходе реакции в финальную стадию и образовании «браун»-продуктов, при этом малая интенсивность полос может быть связана с еще относительно низким содержанием меланоидинов в реакционной системе на данном этапе процесса [8].
Рис. 2. Спектры поглощения реакционной системы D-лактоза (0.005 моль) – п-толуидин (0.005 моль), регистрируемые при различной продолжительности нагревания (62% EtOH, l = 2 см).
Таким образом, в данном случае есть основания предполагать общепринятую в слабокислых и нейтральных средах последовательность стадий «браун»-реакции через образование ППА с последующей деструкцией последних (1,2-енолизация), что, вероятно, сопровождается процессом расщепления дисахаридной структуры с элиминированием галактозы [4], и далее в процессах могут участвовать более активные производные моносахаридов. Спектры поглощения, снятые отдельно для системы D-глюкоза – п-толуидин (рис. 3) имеют близкий характер полос поглощения, что может служить дополнительным доводом в пользу возможности протекания процесса образования моноз из лактозиламина в условиях эксперимента. Более высокие по абсолютному значению величины оптических плотностей при меньшей продолжительности термостатирования обусловлены повышенной реакционной способностью глюкозы, при этом положения максимумов поглощения остаются практически неизменными во времени, а их формирование наблюдается практически при тех же значениях длин волн, что и в случае реакции п-толуидина с лактозой.
Рис. 3. Спектры поглощения реакционной системы D-глюкоза (0.005 моль) – п-толуидин (0.005 моль), регистрируемые при различной продолжительности нагревания (62% EtOH, l = 2 см).
Конечный продукт «браун»-реакции был выделен в твердом состоянии в виде порошка коричневого цвета из реакционной системы D-лактоза - п-толуидин. В его ИК-спектре (рис.4) отмечаются полосы, характерные как для фуранов 1020 см-1 (νСОС), 740 см-1 (δС-Н), а также α,α’-дизамещенных фурановых олигомеров 790 см-1 [9], так и для азотсодержащих гетероциклов, в частности для N-замещенных пирролов 1430 см-1 (νC-Npyr), при этом полоса 1070 см-1, традиционно относимая к деформационным колебаниям (δС-Н)α отсутствует, что указывает на наличие α,α’-дизамещенных пиррольных структур [10]; поглощение при 850 см-1 отвечает п-дизамещенной бензольной структуре в составе меланоидинов.
Можно также предположить, что «браун»-полимеры, образующиеся в водно-спиртовых средах в системе D-лактоза - п-толуидин, являются в значительной степени продуктами реакций меланоидинообразования, поскольку аминокарбонильные взаимодействия в изученных условиях кинетически превалируют над параллельными процессами изомеризации лактозы, ее карамелизации и другими побочными реакциями [11], что может быть использовано для направленного получения меланоидинов заданного функционального назначения.
Рис. 4. ИК-спектр конечного продукта «браун»-реакции в системе D-лактоза - п-толуидин (KBr, 1:100).
Заключение
Лактоза является одним из важнейших дисахаридов, реакционная способность которой по отношению к аминопроизводным определяет ее потенциал как биологически активного компонента природных систем. Изучению аминокарбонильных взаимодействий в водных растворах посвящено значительное количество исследований, при этом в качестве реагентов традиционно представлены амины и аминокислоты алифатического ряда, реакции в неводных и смешанных растворителях, а также взаимодействия с аренаминопроизводными практически не изучены. Нами получены аминоконъюгаты D-лактозы с п-аминобензойной кислотой и п-толудином в водно-спиртовой среде (62% EtOH), установлена их различная активность в условиях перегруппировки Амадори и последующей кислотно-каталитической деструкции, ведущей к образованию «браун»-продуктов. Спектрофотометрическое изучение систем D-лактоза-ариламин позволило подтвердить путь образования меланоидинов из N-п-толиллактозиламина через стадию изомеризации последнего в дезокситолуидинолактулозу с ее последующей деструкцией, при этом N-п-карбоксифениллактозиламин при нагревании в присутствии уксусной кислоты остается стабильным, что связано с низкой донорной активностью гликозидного азота, находящего под влиянием акцепторного агликона. Совместный анализ УФ - и ИК-спектров указывает на деградацию продукта перегруппировки Амадори в системе D-лактоза - п-толуидин, сопровождающуюся разрывом О-гликозидной связи, с образованием пре-меланоидинов и последующее формирование конденсированных структур «браун»-полимеров, содержащих фурановые и N-толилпиррольные фрагменты.
Выводы
1. Представлены результаты по изучению взаимодействия D-лактозы с замещенными ароматическими аминами, в частности с п-аминобензойной кислотой и п-толуидином. Показано, что на первой стадии образуются соответствующие N-ариллактозиламины, при этом оптимальными растворителями для их синтеза определены смешанные водно-спиртовые составы с содержанием этанола 60-65%.
2. Методами спектрофотометрии и ИК-спектроскопии показано, что формирование меланоидинов из N-п-толиллактозиламина в процессе его кислотно-каталитической деструкции протекает через образование и деградацию продукта перегруппировки Амадори, существенно менее основный N-п-карбоксифениллактозиламин в изученных условиях значительно более устойчив к изомеризации и меланоидинообразованию.
3. На основании данных спектроскопии сделано предположение о структуре «браун»-продуктов в системе D-лактоза – п-толуидин, определяемой нами как полимерной, включающей α,α’-дизамещенные фурановые и N-толилпиррольные фрагменты.
Литература
[1] , , Серов и ее производные. СПб.: Профессия, 2007.768 с.
[2] R. Kublashvili, M. Labartkava, K. Giorgadze, N. Karkashadze. N-lactosylation of amino benzoic acids. Bull. Georg. Nat. Acad. Sci. 2012. Vol. 6. No.1. P. 117-120.
[3] S. Adachi. The preparation of N-p-nitrophenylglycosylamines of aldodisaccharides. Carbohydr. Res. 1969. Vol.10. No.1. P. 165-167.
[4] R. Tressl, E. Kersten, G. Wondrak, D. Rewicki. Fragmentation of sugar skeletons and formation of Maillard polymers. The Maillard reaction in food and medicine. J. O’Brien, H. Nursten. Cambridge: Woodhead Publishing Limited. 2005. P. 69-75.
[5] S-C. Chen, J. S.-B. Wu. Maillard browning in ethanolic solution. J. Food. Sci. 2004. Vol. 69. No. 4. P. 273-279.
[6] L. Kroh. Caramelization in food and beverages. Food Chem. 1994. Vol. 51. No. 3. P. 373-379.
[7] N. Bridiau, S. Cabanel, T. Maugard. Facile synthesis of pseudo-C-glycosyl p-amino-DL-phenylalanine building blocks via Amadori rearrangement. Tetrahedron. 2009. Vol. 65. No. 4. P. 531-535.
[8] A. P. Echavarria, J. Pagan, A. Ibarz. Kinetic of color development in glucose/amino acid model systems at different temperatures. Scientia Agropecuaria. 2016. Vol. 7. No. 1. P. 15-21.
[9] X.-G. Li, Y. Kang, M-R. Huang. Optimization of polymerization conditions of furan with aniline for variable conducting polymers. b. Chem. 2006. Vol. 8. No. 5. P. 670-678.
[10] A. K.D. Diaw, A. Yassar, D. Gningue-Sall, J.-J. Aaron. Synthetic routes, characterization, electrochemical and spectral properties of p-substituted N-phenylpyrrols. ARKIVOC. 2008. Vol. 17. P. 122-144.
[11] M. A.J. S. Van Boekel. Effect of heating on Maillard reaction in milk. Food Chem. 1998. Vol. 62. No. 4. P. 403-414.
Interaction of D-lactose with aromatic amines
in aqueous-ethanolic medium
© Igor Sergeevich Cherepanov, Guliamza Minnullovna Abdullina
and Viktor Ivanovich Kornev
Fundamental and Applied Chemistry Division. Udmurt State University. UdSU.
Universitetskaya 1. Izhevsk, 426034. Udmurt Republic. Russia.
Tel.: +7(3412)916-437. E-mail: *****@***ru.
Keywords: D-lactose, aromatic amines, browning-reactions, N-aryllactosylamines, melanoidins.
Abstract
Results on studying of interaction of D-lactose with the substituted arylamines, in particular with p-amino benzoic acid and p-toluidine are presented. Corresponding N-aryllactosylamines are shown as products on the first stage of reaction; the mixed aqueous-alcoholic solutions with the content of ethanol of 60-65% are defined as an optimum solvent for synthesis. An acid-catalytic destruction of N-lactosylamines was studied by the spectrophotometry and IR-spectroscopy; it is shown, that formation of melanoidins from p-tolyllactosylamine proceeds through formation and degradation of Amadori rearrangement product, significantly less basic N-p-carboxyphenyllactosylamine is much stable to isomerization and formation of melanoidins in the studied conditions. Based on the spectroscopy data obtained the structure of "brown"-products formed in D-lactose – p-toluidine system was determined as polymer, containing α,α’-disubstituted furan and N-tolylpyrrole fragments.
|
