Необходимые условия успешного проведения анализа.
Для исключения ложно-положительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального пророста. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащие осадок и агрегаты, путем центрифугирования. Не использовать сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией. Избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов. Не следует тестировать суммарные образцы, содержащие несколько различных сывороток.
4.УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Результаты учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОПкк) не превышает 0,15, в лунках с К - среднее значение ОП (ОПк-) не более 0,2, а в лунках с К+ среднее значение ОП (ОПк+) не менее 0,5.
Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше ОПкрит. ОПкрит рассчитывают по формуле:
ОПкрит.= ОПк - + 0,2.
При количественном определении титра антител титром антител к вирусу паротита в сыворотке следует считать последнее разведение исследуемой сыворотки, значение ОП в которой превышает значение ОПкрит.
5. ФОРМА ВЫПУСКА
В набор тест-системы входят:
1 Иммуносорбент - планшет с иммобилизованным антигеном
вируса паротита 1 планшет
2. К+ - положительный контрольный образец 1 флакон,1,3 мл
3. К - - отрицательный контрольный образец 1 флакон, 1,5 мл
4. Конъюгат G - моноклональные антитела мыши к IgG человека
с пероксидазой хрена 1 флакон, 0,2 мл
5. РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток 1 флакон, 15 мл
6. РБР-К - разводящий буферный раствор для конъюгата 1 флакон, 13 мл
7. РПР-С – раствор для предварительного разведения сывороток 1 флакон, 13 мл
8. ФСБ-Т - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора
с твином, 25-ти кратный 1 флакон, 26 мл
9. БРС - буферный раствор для субстрата 1 флакон, 13 мл
10. ТМБ - хромоген ТМБ в DMSO 1 флакон, 0,7 мл
11. Стоп-реагент (раствор серной кислоты) 1 флакон, 6 мл
СРОК ГОДНОСТИ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ
Срок годности тест-системы 9 месяцев со дня выпуска. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.
Хранение в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 ºС.
Транспортирование производить в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 ºС. Допускается транспортирование при температуре до 25 ºС в течение 10 суток. На дальние расстояния только авиатранспортом.
Рекламации на качество наборов направлять в ООО “ИмДи-спектр” по адресу: (630559, Новосибирская область, Новосибирский р-н, пгт. Кольцово, а/я 172, тел./
И Н С Т Р У К Ц И Я
ПО ПРИМЕНЕНИЮ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСИТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА G К ВИРУСУ ПАРОТИТА
"Паротит-IgG-антитела"
Диагностическая тест-система "Паротит-IgG-антитела" представляет собой набор реагентов для определения антител к вирусу паротита в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа: иммуносорбент - планшет с иммобилизованным антигеном вируса паротита, К+ -положительный контрольный образец: сыворотка крови человека, содержащая антитела класса G к вирусу паротита, инактивированная, прозрачная жидкость красного цвета; К - -отрицательный контрольный образец: сыворотка крови человека, не содержащая антител, инактивированная, прозрачная бесцветная или светло-желтая жидкость; конъюгат G – конъюгат: моноклональные антитела мыши к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена, прозрачная жидкость зеленого цвета; РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток, прозрачная жидкость синего цвета; РБР-К - разводящий буферный раствор для конъюгата, прозрачная жидкость зеленого цвета; РПР-С – раствор для предварительного разведения сывороток, прозрачная жидкость от светло-коричневого до коричнево-зеленого цвета; (ФСБ-Т) х25 - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, прозрачная, слегка опалесцирующая, бесцветная жидкость; БРС – буферный раствор для субстрата с перекисью водорода, прозрачная бесцветная жидкость; ТМБ –хромоген: раствор тетраметилбензидина в DMSO, бесцветная или светло-желтая жидкость; стоп-реагент – прозрачная бесцветная жидкость.
Набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные образцы.
НАЗНАЧЕНИЕ
Тест-система предназначена для определения антител класса G к вирусу паротита в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Тест-система может быть использована для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию и в эпидемиологических исследованиях.
Тест-система представляет собой иммуноферментную систему на основе очищенного вируса паротита. Антитела к вирусу паротита, появляющиеся в крови человека после вакцинации или после перенесенного заболевания, взаимодействуют с очищенным вирусом паротита, сорбированным на планшете. Комплекс антиген-антитело выявляют с помощью иммуноферментного конъюгата с пероксидазой хрена.
Тест-система может быть использована как для качественной оценки противопаротитных антител, так и для определения титра антител к вирусу паротита в сыворотках крови.
Для отбора исследуемых проб и компонентов тест-системы, как и для титрования сыворотки, используются автоматические пипетки со сменными наконечниками типа "Gilson" или аналогичные с погрешностью измерений объёмов не более 5%.
Несмотря на то, что тест-система содержит в качестве антигена инактивированный вирус паротита и инактивированные контрольные образцы, с системой следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом: работать в резиновых перчатках, не пипетировать ртом, все использованные материалы подвергать обработке раствором этилового спирта с объемной долей 70% или 6%-ным раствором перекиси водорода c последующей выдержкой при температуре 20-22 0С не менее 2 ч.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Внимание: Перед использованием набора все компоненты тест-системы необходимо выдержать не менее 30 минут при температуре 18-25оС.
При постановке ИФА нельзя использовать компоненты из наборов разных серий или смешивать их при приготовлении растворов.
1. Подготовка исследуемых образцов.
Для проведения анализа используют образцы сыворотки или плазмы крови объемом не менее 20 мкл.
Скрининг исследуемых сывороток проводят в разведении 1:100. Для этого готовится предварительное разведение исследуемых сывороток 1:10, т. е. в лунки вспомогательного планшета (в набор входит) вносят по 90 мкл РПР-С и по 10 мкл исследуемых сывороток. Тщательно перемешивают пипетированием, при этом РПР-С меняет свой цвет.
2. Приготовление реагентов.
2.1. Приготовление ФСБ-Т.
При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с ко нцентратом выдержать при температуре (37±1) °С до полного растворения солей.
Содержимое одного флакона с ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 л и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.
В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в мерный цилиндр внести концентрат ФСБ-Т из флакона и добавить дистиллированную воду в соответствии с таблицей 1.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т хранить при температуре от 2 до 8°С в течение срока годности набора, раствор ФСБ-Т - при температуре от 2 до 8 °С в течение 2-х недель.
2.2 Подготовка РБР-С, РБР-К, БРС.
РБР-С, РБР-К, БРС, - готовы к использованию.
В РБР-С и РБР-К возможно выпадение осадка. Перед использованием тщательно перемешать.
Хранение: после вскрытия флакона раствор хранить при температуре от 2 до 8°С в течение срока годности набора.
2.3 Подготовка контрольных образцов.
К+ и К - готовы к использованию.
Хранение: после вскрытия флакона до 48 ч при температуре от 20 до 25 °С, в течение срока годности набора при температуре от 2 до 8 °С.
2.4 Приготовление рабочего разведения конъюгата:
Для приготовления рабочего разведения конъюгата в чистый флакон отобрать необходимое количество РБР-К и добавить конъюгат в соответствии с таблицей 1. Раствор тщательно перемешать, не допуская вспенивания.
Хранение: рабочий раствор конъюгата до 15 мин при температуре от 20 до 25 °С, остаток концентрата при температуре от 2 до 8°С в течение срока годности набора.
2.5 Приготовление рабочего раствора субстрата.
При пониженной температуре возможна кристаллизация ТМБ во флаконе. В этом случае перед приготовлением рабочего раствора субстрата выдержать флакон с ТМБ в течении 3-5 минут при температуре (37±1)°С до полного растворения ТМБ.
Раствор ТМБ готовить непосредственно перед использованием в защищенном от света месте.
Для приготовления рабочего разведения ТМБ в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС в мл и добавить ТМБ в соответствии с таблицей 1.
Раствор тщательно перемешать, не допуская вспенивания.
Хранение: рабочий раствор субстрата до 20 мин при температуре от 20 до 25 °С в защищенном от света месте, остаток ТМБ хранить в течении срока годности набора при температуре от 2 до 8°С.
2.6 Подготовка стоп-реагента.
Стоп –реагент готов к использованию.
ПРОВЕДЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
1. В лунки планшета А1 и В1 внести К+ объемом по 100 мкл, в лунки С1 и D1 внести К - объемом по 100 мкл. В остальные лунки планшета вности РБР-С объемом по 90 мкл. И добавить по 10 мкл предварительно разведенных образцов сыворотки, тщательно перемешать пепетированием. Две лунки оставить с раствором РБР-С, для контроля конъюгата. Затем планшет закрыть крышкой или клейкой лентой и инкубировать 30 мин при температуре (37+1) 0С.
Для определения титра противопаротитных антител сыворотки раститровываются в лунках по вертикали. Во все лунки ряда А, начиная с лунки "2А" (лунки 2-12), вносится по 180 мкл РБР-С. Во все остальные лунки вносят по 100 мкл РБР-С. Во все лунки ряда “А” ,начиная с лунки “2А”(лунки 2-12) вносят по 20 мкл исследуемых сывороток, предварительно разведенных в 10 раз и раститровывают по своему вертикальному ряду ряду с шагом разведения 1:2. Например, 20 мкл разведенной сыворотки вносят в лунку “2А”, тщательно пипетируют, отбирают 100 мкл и переносят в лунку “2В”. Процедуру повторяют и переносят 100 мкл в лунку “2С” и так далее до лунки “2Н”. Из лунки “2Н” необходимо отобрать 100 мкл для того, чтобы объемы жидкости во всех лунках ряда были одинаковы. Аналогичным образом в лунках ряда 3 (от лунки “3А” до лунки “3Н”) раститровывается следующая испытуемая сыворотка и так далее. Таким образом, в лунках ряда “А” остаются сыворотки в разведении 1:100; в лунках ряда “В” – в разведении 1:200; в лунках ряда “С” – в разведении 1:400 и так далее, с шагом 1:2.
После каждого пипетитрования необходимо менять пипетку или наконечник автоматической пипетки. После титрования закрыть планшет крышкой и инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 0С.
2. По окончании инкубации содержимое лунок собрать в сосуд с дезинфицирующим раствором. Планшет промыть 5 раз раствором ФСБ-Т, при помощи автоматического промывателя или вручную, добавляя его в каждую лунку не менее чем по 250 мкл, в процессе одного промывания. Время между заполнением и опорожнением лунок должно быть не менее 10 сек., остатки влаги удалить, постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.
3. После промывки и удаления влаги в каждую лунку внести конъюгат в рабочем разведении объемом по 100 мкл (см. п. 2.4). Планшет закрыть, как описано выше, и инкубировать 30 мин при температуре (37+1) 0С.
4. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз и удалить остатки влаги из планшета (см. п. 2).
5. Внести в каждую лунку планшета раствор субстрата объемом по 100 мкл. (см. п. 2.5.) Планшет поместить на 15 мин в защищенном от света месте при температуре(37) 0С.
6. Реакцию остановить внесением в каждую лунку стоп-реагента объемом по 50 мкл и измерить оптическую плотность.
