Занятие 13

Тема: Иммунитет. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Серологические реакции, их механизм. Прямые серологические реакции. Реакции агглютинации, преципитации.

Антигенами называются вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывающие развитие специфических иммунологических реакций.

Природными антигенами являются белки, полисахариды, мукополисахариды, липополисахариды, высокомолекулярные препараты нуклеиновых кислот.

Антигены бактерий. Среди бактериальных антигенов различают структурные, непосредственно связанные с клеткой, и секретируемые во внешнюю среду. В соответствии с принадлежностью антигенов к определенным структурам бактериальной клетки различают следующие их виды:

- соматический антиген - О-антиген. Это антиген клеточной стенки бактерий. У грамположительных бактерий основным соматическим антигеном являются тейхоевые кислоты, у грамотрицательных бактерий - липополисахарид (эндотоксин). О-антиген термостабилен.

- жгутиковый антиген - Н-антиген. Имеется только у подвижных бактерий, состоит из белка флагеллина, термолабилен.

- капсульный антиген - К-антиген. Поверхностный антиген вещества капсулы. Имеет мукополисахаридную или белковую природу, термолабилен. Разновидностью капсульного антигена является Vi-антиген (антиген вирулентности), который имеется у возбудителя брюшного тифа.

Корпускулярными антигенами называются антигены, связанные с бактериальной клеткой, либо с другими нерастворимыми частицами, например, эритроцитами. К секретируемым (растворимым) бактериальным антигенам относятся экзотоксины и экзоферменты, в том числе, ферменты агрессии.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Антителами называются белковые молекулы, которые образуются в ответ на попадание в организм антигенов и специфически с ними связываются. Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины (Ig). Различают следующие классы антител: IgA, IgG, IgE, IgM, IgD.

Серологические реакции – это реакции между антигеном и антителом in vitro. Продуктом этой реакции являются иммунные комплексы. Реакции между антигеном и антителом, происходящие in vivo, являются это важнейшим защитным механизмом устранения чужеродных антигенов из организма.

Серологические реакции используются для количественного и качественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Серологические реакции применяются для выявления неизвестного антигена с помощью известных антител, либо для выявления неизвестных антител с использованием известных антигенов. При выявлении неизвестного антигена (микроорганизма, белка и т. д.) используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами. Такие антисыворотки содержат антитела. При определении наличия и титра антител в сыворотке крови используют специальные антигенные диагностикумы (взвеси эталонных инактивированных микроорганизмов).

Таким образом, в серологических реакциях один из двух основных компонентов (антиген или антитело) всегда должен быть известным.

Серологические реакции подразделяются на прямые и непрямые. В прямых серологических реакциях участвуют только антигены и антитела. Результат прямых серологических реакций наблюдается непосредственно по изменению оптических свойств раствора (образование хлопьев, помутнения, опалесценции). К прямым серологическим реакциям относятся реакции агглютинации, преципитации и флоккуляции.

В непрямых серологических реакциях для визуализации результата взаимодействия антигенов и антител используются индикаторные системы. В качестве индикаторных систем чаще всего применяют эритроциты. К непрямым серологическим реакциям относятся реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой и др.

Реакция агглютинации (РА). Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия с ними специфических антител. Для проведения РА необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитела (агглютинины); 3) раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия). В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса).

Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стек­ло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1:10 - 1:20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара,  переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 мин. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрица­тельной реакции жидкость остается равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации). В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 часа в термостат при 37°С.  Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе “четыре плюса”: полная агглютинация -  4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +.  За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+. Развернутую реакцию агглютинации проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля),  бруцеллеза (реакции Райта).

Реакция преципитации (РП). Реакцией преципитации называется осаждение из ра­створа антигенов (преципитиногенов) при воздействии иммун­ной сыворотки (преципитина). При этом образуется осадок (преципитат). Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов – в зоне эквивалентности. Зоной эквивалентности называется область, в которой все антитела связаны с антигеном. При избытке антигенов или антител образовавшийся осадок растворяется. В реакции преципитации принимают участие только растворимые антигены (экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада бактериальных клеток - лизаты, фильтраты и т. д.). Антитела, способные вызывать преципитацию антигена, должны иметь не менее двух валентностей. Преципитирующие сыворотки изготавливают  путем гипериммунизации (многократной иммунизации) животных (кроликов).

Реакция кольцепреципитации. В  пробирку наливают 1,0 мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пипеткой медленно наслаивают по стенке пробирки (пробирку держат в наклонном положении) антиген в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении антигена на сыворотку четко видна граница между двумя слоями жидкости в виде белого кольца. Результаты реакции учитывают  через 1-2 минуты. С помощью РП можно выявить не только видовую, но и групповую специфичность белка. Например, определить степень родства различных видов животных и растений. В судебной медицине РП используется для определения видовой принадлежности белка (сыворотки крови). Применение РП для санитарно-гигиенического контроля пищевых продуктов позволяет выявить фальсификацию мясных, рыбных, мучных изделий, примеси в молоке и т. д.

Недостатками РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании, а также невозможность установить количество разных антигенов, участвующих в формировании преципитата.

Этих недостатков лишены реакции преципитации в геле. К ним относятся реакция иммунодиффузии по Оухтерлони, и реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони. Метод иммунодиффузии основан на встречной диффузии антигена и антител в агаровом геле. Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку,  после затвердевания в нем вырезают лунки диаметром 2-3 мм, которые заполняют антигеном или сывороткой (антителами). Антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу и в месте контакта образуют линии преципитации в виде белой полосы.

Реакция радиальной  иммунодиффузии по Манчини. При постановке  этой реакции в расплавленный агар вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела. После застывания геля в нем делают лунки, в которые вносят антиген. Антиген, диффундируя в гель, взаимодействует с антителами, присутствующими в агаре. В результате образуется радиальная зона преципитации, диаметр которой пропорционален концентрации антигена. Реакцию  используют для количественного определения в крови иммуноглобулинов различных классов.

Реакция флоккуляции. Реакцией флоккуляции называется появление опалесценции или хлопьевидной массы при добавлении в пробирку с токсином (анатоксином) антитоксической сыворотки. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Литература для подготовки к занятию:

1. Борисов микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.

3. Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.