Ассоциация и сравнительный анализ себорейного кератоза с вирусом паппиломы человека у иммуносупрессивных и иммунокомпетентных пациентов

АССОЦИАЦИЯ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СЕБОРЕЙНОГО КЕРАТОЗА С ВИРУСОМ ПАППИЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА У ИММУНОСУПРЕССИВНЫХ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ПАЦИЕНТОВ.

1, 2, 3, 4, 5, 6

2Кафедра дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ (зав. – ) ГБУЗ МО МОНИКИ им. ;

¹Отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии (руководитель – ) ГБУЗ МО МОНИКИ им. ;

3Кафедра кожных и венерических болезней (зав. – ) ГОУ ВПО ФППОВ Первый МГМУ им. ;

4Отделение хронического гемодиализа и трансплантации почки (руководитель – ) ГБУЗ МО МОНИКИ им. ;

5Клиника «Премиум Эстетикс», г. Москва

6Отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва (руководитель – к. м.н, )

Резюме к статье

Цель исследования. Изучить ассоциацию себорейного кератоза (СК) с вирусом папилломы человека на основе количественного анализа ДНК ВПЧ рода beta.

Материалы и методы. В исследовании принимали участие 60 реципиентов почечного трансплантата (РПТ), у 20 из них имелись множественные СК, а также 22 иммунокомпетентных пациента (и/к) с СК. Контрольная группа была представлена 49 добровольцами.

Забор материала осуществляли в стерильных условиях борами (микробиоптаты). После пробоподготовки с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора проводилось определение ВПЧ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time). Амплификация и детекция проводилась на приборе «Rotor-Gene» 3000 («Corbett Research», Австралия).

Для количественного определения ВПЧ рода beta, использовались рекомбинантные плазмидные положительные контроли, а также контрольные плазмиды фрагмента β-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовались четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов).

Результаты. Анализ предварительных данных показал, что у реципиентов почечного трансплантата кератотические очаги появляются как на открытых, так и на закрытых участках кожи.

В себорейных кератомах и видимо здоровой коже РПТ с высокой частотой выявляли ДНК ВПЧ рода beta - 81% и 55% случаев соответственно, по сравнению с кожей здоровых доноров – в 47% случаев

Заключение. В результате проведенного исследования показана высокая выявляемость ДНК ВПЧ у РПТ как в очагах СК, так и в видимо здоровой коже. У иммунокомпетентных пациентов отмечена более высокая выявляемость ДНК ВПЧ в очагах СК по сравнению с видимо здоровой кожи. Вирусная нагрузка в СК

Ключевые слова: доброкачественные эпителиальные образования кожи (ЭОК), себорейная кератома, ВПЧ рода beta, реципиенты почечного трансплантата (РПТ), иммуносупрессивные (и/с) пациенты, иммунокомпетентные (и/к) пациенты, детекция ДНК ВПЧ рода beta в режиме реального времени (Real-Time).

- к. м.н., ассистент кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. .

Тел. [phone]; e-mail:*****@***ru

– д. м.н., профессор, руководитель отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. .

Тел. [phone]

– д. м.н., профессор кафедры кожных и венерических болезней ГОУ ВПО ФППОВ Первый МГМУ им. .

Тел. [phone];

– к. м.н., старший научный сотрудник отделения хронического гемодиализа и трансплантации почки ГБУЗ МО МОНИКИ им. .

Тел. [phone]

– врач дерматовенеролог, косметолог, , клиника «Премиум Эстетикс».

Тел. [phone]

– младший научный сотрудник отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии в ФГБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Тел. [phone]

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) – одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Изучение этиологии и патогенеза ЭОК представляет значительный интерес для оптимизации лечения и профилактики этих опухолей (1).

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены (2). Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям(2). В настоящее время в связи с достижениями в области молекулярной биологии предпринимаются попытки определения роли вируса папилломы человека (ВПЧ рода beta) в развитии отдельных вариантов ЭОК – плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, актинического кератоза, кератоакантомы, себорейного кератоза (3).

Обнаружение ВПЧ рода beta в ЭОК может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистенции, характерной для факторов естественной резистентности(2). Поэтому, помимо выявления ВПЧ рода beta, необходимо проводить количественное измерение вирусной нагрузки, определение которой является сравнительно новым подходом в диагностике ВПЧ-инфекции для мониторинга дальнейшего лечения и профилактики (4,6).

Отсутствие во большинстве очагов транскрипционной активности и низкая вирусная нагрузка, сопоставимая с таковой в здоровой коже, противоречат предположению о роли ВПЧ в стимуляции опухолевого роста. Тем не менее, ряд популяционных исследований, молекулярные и патоморфологические данные подтверждают, что ВПЧ рода beta может играть этиологическую роль в развитии ЭОК(3). Иммуносупрессия также является важным кофактором развития ЭОК. Формирование ВПЧ-ассоциированных бородавок, ороговевающих кожных опухолей (в том числе себорейного кератоза – СК) и немеланомных видов рака кожи значимо повышается после трансплантации внутренних органов (4,5).

Себорейный кератоз (СК) – распространенная доброкачественная ЭОК неизвестной этиологии. Из-за схожей с бородавками морфологической картины, ВПЧ рассматривается как один из возможных этиолологическоих факторов данных опухолей. Ассоциация ВПЧ с негенитальными СК была подтверждена в ряде исследований. Zhao et al. обнаружили ВПЧ в 4 из 89 СК методом световой и электронной микроскопии [73]. Li et al. обнаружили ВПЧ рода beta в 42 из 55 (76%) биоптатах СК у ОТР по сравнению с 13 из 48 (27%) образцами здоровой кожи (p<0,005) [36]. Наряду с этими результатами в ряде исследований, в основном с использованием менее чувствительных разновидностей ПЦР, ДНК ВПЧ в СК обнаружить не удалось[39].

С учетом вышеизложенного, проведение исследований, изучающих ассоциацию ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК с ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию СК с ВПЧ на основе количественного анализа ДНК ВПЧ.

Задачи исследования:

1.  Исследовать встречаемость ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже реципиент почечного трансплантата (РПТ) и иммунокомпетентных пациентов.

2.  Изучить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ и иммунокомпетентных лиц.

Материалы и методы.

Группа лиц, вошедших в исследование, была сформирована в соответствии с данными мировой научной литературы, согласно которым ВПЧ рода beta ассоциирован c отдельными вариантами доброкачественных ЭОК, а именно, с себорейным кератозом.

Всего на базе отделений дерматовенерологии и дерматоонкологии, а также хронического гемодиализа и трансплантации почки МОНИКИ им. было обследовано 60 реципиентов почечного трансплантата (РПТ), у 20 из них имелись множественные СК. Было произведено исследование из очагов СК и видимо здоровой кожи области плеча.

Также были обследованы 22 иммунокомпетентных пациентов (и/к) с СК. Аналогично у каждого иммунокомпетентного пациента исследована видимо здоровая кожа.

Среди 20 реципиентов почечного трансплантата (РПТ) было 10 мужчин и 10 женщин в возрасте 46±10 лет (от 22 до 60). Длительность иммуносупрессии составила от полугода до 13,5 лет (медиана – 3 года). 16 пациентов РПТ получали микофенолата мофетил, такролимус и преднизолон и 4 – циклоспорин А в комбинации с другими иммуносупрессивными препаратами. Вирусная патология (вульгарные и подошвенные бородавки, опоясывающий герпес) зафиксирована у 4 и/с пациентов, грибковые инфекции (разноцветный лишай, кандидоз слизистой оболочки рта или наружных половых органов) - у 9, акне и фолликулит – у 8 пациентов, себорейный дерматит, алопеция, ксероз – у 5 и ятрогенные осложнения (гиперплазия десен, гипертрихоз, пурпура) - у 4 человек.

Среди иммунокомпетентных лиц с СК было 11 мужчины и 11 женщин в возрасте 43±15 лет (от 24 до 78) грибковые инфекции (микоз стоп) зафиксированы у 9, себорейный дерматит –у 3, ксероз – у 5, склеродермия –у 4.

Контрольная группа была представлена 49 добровольцами, из них 21 мужчина и 28 женщин в возрасте 58±14,5 лет (от 29 до 78), [АП1] у которых кожные заболевания, в том числе, ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. (таб.1).

Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи пакета программ Statistica 10.0. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат». Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов; сравнение несвязанных выборок осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни, связанных - с помощью критерия Вилкоксона. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Генодиагностика ВПЧ-инфекции проводилась на базе ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора [3].

Забор материала осуществляли в стерильных условиях борами (микробиоптаты). Исследуемый материал помещали в пробирки с транспортной средой и хранили при температуре минус 70 С.

Пробоподготовка проводилась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Определение ВПЧ в биоптатах проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real-Time). Метод ПЦР в «режиме реального времени» позволил определить абсолютное количество геномов ВПЧ рода beta и ДНК человека в пробе. Амплификация и детекция проводилась на приборе «Rotor-Gene» 3000 («Corbett Research», Австралия).

Для количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфичности, использовались рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta - 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (M. Favre Institut Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, France; E.-M. de Villiers, Abteilung tumorvirus-Charakterisierung Referenzzenturum fur Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента β-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовались четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов):

1-я - для выявления генотипов вида β1 (5, 8, 12, 14, 21, 19, 25, 47, 36);

2-я - для выявления генотипов вида β2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80);

3-я - для выявления генотипов вида β3 (49, 75, 76);

4-я - для выявления генотипов вида β4 (92), β5 (96), β1 (20,24 и 93 типы).

Во все четыре системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по ß-глобиновому гену человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля).

С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов СК и здоровой кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, использовалась методика нормирования количества вируса на количество клеток человека, что позволило получить надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи. Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производился по формуле: ВН = lg ((кол-во ДНК ВПЧ / кол-во ДНК чел.) × 105)[1].

Результаты

Полученные данные представлены в виде таблиц.

Таблица 1. Распределение РПТ и иммунокомпетентных пациентов по нозологиям

	Группа новообразований	Количество больных	Количество исследованных очагов
иммуносупресивные	Себорейный кератоз	20	21
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	20	20
иммунокомпетентные	Себорейный кератоз	22	22
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	22	22
Здоровая кожа доноров	49	49

Таблица №2. Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в себорейных кератомах и образцах видимо здоровой кожи.

	Исследуемые образцы	Кол-во образцов	Количество ВПЧ - образцов	Количество ВПЧ + образцов
Абс.	%	Абс.	%
иммуносупрессивныетентные	Себорейный кератоз	21	4	19%	17	81%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	20	9	45%	11	55%
иммунокомпетентные	Себорейный кератоз	22	8	36%	14	64%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	22	13	59%	9	41%
Здоровая кожа доноров	49	26	53%	23	47%

Таблица 3.

Сравнительная частота обнаружения различных видов ВПЧ рода beta в образцах себорейных кератом, видимо здоровой кожи РПТ и и/к пациентов.

	Исследуемые образцы	Кол-во ВПЧ (+) образцов	Виды ВПЧ
beta-1*	beta-2*	beta -3*	beta - 4,5*
	(%)		(%)		(%)		(%)
иммуносупресивные	Себорейный кератоз	17	12	71%	12	71%	6	35%	5	29%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	11	10	91%	7	64%	3	27%	5	45%
иммунокомпетентные	Себорейный кератоз	14	9	63%	9	63%	2	14%	2	14%
Видимо здоровая кожа у лиц с СК	9	6	67%	3	33%	1	11%	1	11%[АП2]
Здоровая кожа доноров	23	9	39%	8	35%	4	17%	8	35%

*в том числе в ассоциации с другими видами

Анализ предварительных данных показал, что у реципиентов почечного трансплантата кератотические очаги появляются как на открытых, так и на закрытых участках кожи.

В себорейных кератомах и видимо здоровой коже РПТ с высокой частотой выявляли ДНК ВПЧ рода beta - 81% и 55% случаев соответственно, по сравнению с кожей здоровых доноров – в 47% случаев.

Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ рода beta в СК и видимо здоровой коже РПТ составила 2,8(1,9;5,4) и 2,0(1,3;2,5), соответственно (данные представлены в виде медиана(25 перцентиль;75 перцентиль)). Сходные результаты были получены относительно вирусной нагрузки в СК и видимо здоровой коже иммунокомпетентных лиц: 1,8(1,2;2,3) и 2,2(1,6;1,8), соответственно. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ в здоровой коже доноров была значимо ниже и составила 1,5(0,9;1,9).

У реципиентов почечного трансплантата в очагах СК обнаруживались различные виды ВПЧ рода beta: 1,2,3 и 4,5 (71%, 71%, 35%, и 29% соответственно).

У РПТ с единичными СК (от 1 до 5 по всему телу) ДНК ВПЧ рода beta обнаруживали в 43% случаев. При множественных очагах СК (от 5 и более) у РПТ отмечалась тенденция к более частому обнаружению ДНК ВПЧ рода beta - в 91% случаев.

Сохраняется пробел в нашем понимании как взаимосвязи между ВПЧ и ЭОК, так и механизмов, за счет которых ВПЧ может вызывать их развитие. Невозможность выявить ВПЧ во всех ЭОК, вероятно, связана с ограничениями используемых методик молекулярной диагностики, при этом количественный анализ вирусных геномов позволяет более объективно судить о характере присутствия ВПЧ в опухолях кожи. Необходимо больше исследований для подтверждения или опровержения роли ВПЧ рода beta в развитии ЭОК в общей популяции и особенно среди иммуносупрессированных лиц.

Список сокращений

РПТ – реципиент почечного трансплантата

ВПЧ – вирус папилломы человека

и/с – иммуносупрессивные

и/к – иммунокомпетентные

СК – себорейные кератомы

ЭОК - эпителиальные образования кожи

Список литературы

1. Кладова эпителиальных опухолей кожи в вирусами папилломы человека // Диссертация на соискание ученой степени к. м.н., Москва. - 2007.

2. , , еt al. Встречаемость кожных типов вирусов папилломы человека в опухолях кожи // Альманах клинической медицины. Издательство: Московский областной научно-исследовательский институт им. (Москва). - 2006. №9. - P. 44-50.

3. , , Молочков методики количественного определения папилломавирусов рода Бета // VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». Москва - 2006. - P. 97-98.

4. , Галил-, Сергеев // М. Медицина. - 2005.

5. Русских показатели больных единичным и множественным базально-клеточным раком кожи, ассоциированным с вирусом папилломы человека // Автореферат диссертации на соискание ученой степени к. м.н., Челябинск. - 2012.

6. Asgari M. M., Kiviat N. B., Critchlow C. W., Stern J. E., Argenyi Z. B., Raugi G. J. еt al. Detection of human papillomavirus DNA in cutaneous squamous cell carcinoma among immunocompetent individuals // J Invest Dermatol. - 2008. - Vol. 128, №6. - P. 1409-1417.

IARC IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.

Human Papillomaviruses. Lyon. - 2012. - Vol. 90.

de Jong-Tieben L. M., Berkhout R. J., ter Schegget J., Vermeer B. J., de Fijter J. W., Bruijn J. A. еt al. The prevalence of human papillomavirus DNA in benign keratotic skin lesions of renal transplant recipients with and without a history of skin cancer is equally high: a clinical study to assess risk factors for keratotic skin lesions and skin cancer // Transplantation. - 2000. - Vol. 69, №1. - P. 44-49.

Harwood C. A., Surentheran T., McGregor J. M., Spink P. J., Leigh I. M., Breuer J. еt al. Human papillomavirus infection and non-melanoma skin cancer in immunosuppressed and immunocompetent individuals // J Med Virol. - 2000. - Vol. 61, №3. - P. 289-297.

 [АП1]Это реальный возраст пациентов в данной группе, но он расходится с возрастами в других группах.

 [АП2]Исправила